ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Материалы и объем исследований
2.1.1. Организация исследования
Исследования проведены в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего образования «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» в соответствии с планом научно-исследовательских работ кафедры внутренних болезней животных им. Синева А.В.!!!с использованием базы ООО «Многопрофильная ветеринарная клиника травматологии, ортопедии и интенсивной терапии».
Исследования и наблюдение, положенные в основу диссертации, провели в 2015-2018 гг., на базе ООО «Многопрофильная ветеринарная клиника травматологии, ортопедии и интенсивной терапии», куда обращались с больными животными.
Работа выполнена с соблюдением международных принципов Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным(DeclarationofHelsinki, 2003) принципов гуманности, изложенных в Директиве Европейского парламента и Совета Европейского Союза 2010/63/EC «О защите животных, использующихся для научных целей» (Directive 2010/63/EU, 2010).
Объектами исследования являлись 32 кошки разных пород и половозрастных групп, поступившие в ветеринарную клинику и имевшие симптоматику обструктивного бронхита. При выборе животных для обследования учитывали: распространенность и этиологию заболевания, породный и половозрастной состав кошек. Всех животных содержали в домашних условиях и кормили полнорационными сухими кормами премиум-класса. Группы были рандомизированы по полу, возрасту, тяжести течения болезни.
С животными были проведены диагностические исследования и оказана лечебная помощь в соответствии с симптомокомплексом жалоб, характерных дляБА. Общая схема исследований представлена на рисунке 2.1.
После клинического осмотра и анализа результатов объективных методов исследования для дифференциальной диагностики и уточнения диагноза заболевания животным были назначено проведение дополнительных методов исследования (таблица 2.2, рисунок 2.1). В 100 % случаев проведены рентгенография, общий анализ крови и биохимическое исследование крови, эндоскопия и бронхоальвеолярный лаваж,цитологическое исследование, бактериологическое (культуральное, бактериоскопическое, оценку чувствительности к антибиотикам) исследование материала.
Для уточнения и исключения сопутствующих кардиологических заболеваний проводили эхокардиографию всем животным при проведении дополнительной диагностики.
В половине случаев кошкам назначали компьютерную томографию (КТ), определение уровня иммуноглобулина IgE и исследование интрадермальных проб с аэроаллергенами.
Таблица 2.2 — Частотная характеристика методов диагностики, примененных в обследовании животных
Рисунок 2.1 — Частота использования методов в постановке диагноза у кошек
После установления у кошек наличия ОБ с аллергическим компонентом назначали лекарственную терапию. В схеме лечения ОБ с аллергическим компонентом у плотоядных животных применяли препарат ГКС — преднизолон (Prednisolone) в контрольной и экспериментальных группах, а для экспериментальной группы нами была исследована аллерговакцинакомпании Artuvet (Нидерладны), являющаяся новым и перспективным препаратом в схеме терапии ОБ с аллергическим компонентом. Перед применением вакцины 16 животным были проведены кожные аллергические тесты и тесты на специфический иммуноглобулин Е, затем вакцинацию проводили в соответствии с рекомендуемой схемой производителя, а именно первая дозировка составила 0,2 мл, после чего дозировку постепенно увеличивали до 1,0 мл, в течение 12 недель, затем вводилась поддерживающая доза 1,0 ежемесячно.
В свете вышеизложенного, предлагаем рассмотреть порядок проведения клинического исследования. Все исследуемые животные, методом частично детерминированной рандомизации, в зависимости от назначенной схемы лечения, были разделены на основную (n=16) и контрольную (n=16) группы.
В основную группу были включены 16 кошек, которые принимали:
- преднизолон (в индивидуально подобранных дозах из расчета 1 мг/кг, в течение 2 недель с последующей отменой).
затем в течение 7 дней препарат отменяли для проведения аллергопроб. После оценки результатов аллергопроб, схема лечения возобновлялась с дополнительным назначением:
- аллерговакцины (прием препарата осуществлялся в соответствии с протоколом).
Вторую (контрольную) группу составили 16 кошек, которым было назначено:
- преднизолон (в индивидуально подобранных дозах из расчета 1 мг/кг,в течение 2 недель с последующей отменой).
2.Фликсотид на 12 мес.
Эффективность назначенных схем лечения оценивалась в соответствии с поступавшим количеством пациентов, количеству рецидивов проявления ОБ – кашля, результатам цитологического исследования бронхиального секрета.
Продолжительность лечения и наблюдения животных в основной и контрольной группе составила 1 год. Эффективность лечения в группах сравнения оценивали до лечения и после лечения.
2.2. Методика исследований
Диагностику бронхообструктивного синдрома у плотоядных животных проводили с использованием следующих методов:
- Анамнестический метод —сбор информации о заболевании животного получали в процессе опроса их владельцев (Б. В. Уша и др., 2004; Д.Г. Карлсон, Д.М. Гиффин, 2004).
- Клинический осмотр, который включал в себя обследование пациента в соответствии с общепринятыми стандартами (Д.Г. Карлсон, Д.М. Гиффин, 2004; S.E. Little, 2012).
- Аускультацию дыхательной системы проводили в соответствии с общепринятыми методами (Д.Г. Карлсон, Д.М. Гиффин, 2004; S.E. Little, 2012).
- Рентгенографические исследования с целью уточнения наличия и характера структурных нарушений в легких выполняли на переносном цифровом портативном рентгеновском аппарате 9020HF, EcoRay (Корея) по стандартной методике(D. Thrall, 2017).
- Компьютерную томографию при необходимости визуализации органов грудной клетки с большей, чем при рутинном рентгенологическом исследовании, разрешающей способностью, для оценки структурных изменений, в том числе лежащих в основе бронхиальной обструкции, и дифференциальной диагностики с альтернативными патологическими процессами осуществляли на КТ «Philips Neusoft NeuViz 16» (Китай) по стандартной методике(T. Schwarz, J. Saunders, 2013).
- Общий анализ крови для оценки воспалительных и сенсибилизационных реакций проводили на гематологическом анализаторе для ветеринарии «Abacus Junior 5 (Vet) 22» («Diatron», Австрия) с использованием наборов реагентов фирмы «J. T. Baker» (Нидерланды). В крови определяли количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, содержание гемоглобина, цветовой показатель. Лейкограмму и скорость оседания эритроцитовопределяли с общепринятыми методами (Н.А. Горбунов и др., 2013). Забор крови осуществляли натощак из плантарной вены на медиальной поверхности бедра животных в объеме 0,5 мл в пробирки «VACUETTE с K2-EDTA» («Greiner Bio-One», Австрия).
- Биохимические исследования плазмы крови с целью определения метаболических нарушений, острофазовых показателей, функционального состояния органов детоксикации и др. проводили на автоматическом биохимическом анализаторе «BioChem FC-360» («HTI», США) с использованием наборов реагентов фирмы «HighTechnology» (США). Определение содержания общего белка, глюкозы, аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы, щелочной фосфатазы, креатинина, мочевины, фибриногена, белковых фракций, С-реактивного белка, осуществляли в соответствии с общепринятыми методами (Н.А. Горбунов и др., 2013). Забор крови осуществляли натощак из вены на дорсальной поверхности передней конечности плотоядных животных в объеме 1,0 мл в пробирки «VACUETTE пробирки с активатором свертывания крови» («Greiner Bio-One», Австрия).Референтные значения биохимического анализа крови представлены в единицах СИ в соответствии с нормой для собак и кошек (T.S.Campbelletal, 2006).
- Бронхоскопию для оценки состояния слизистой оболочки бронхов, проходимости и взятия лаважной жидкости проводили в соответствие с общепринятыми в ветеринарии методиками (В.В. Синяева, 2016) с помощью бронхоскопа Olympus BF-MP190F (OLYMPUS, Япония).
- Получение бронхиальной слизи и ее цитологическое исследование с целью патоморфологической интерпретации проводили общепринятым методом (М.Ф. Васильев, Е.С. Воронин, Г.Л. Дугин и др., 2003).
- Бактериологическое исследование бронхиальной слизи и определение чувствительности к антибиотикам осуществляли в соответствии со стандартными методиками(Е.Н. Левина, 1983; МУК 4.2.1890-04, 2004).
- Интрадермальные тесты проводили с использованием водных экстрактов аллергенов, которые вводили внутрикожно в дозе 0,05 мл. Оценку внутрикожного теста осуществляли по размеру припухлостей, наличие их эритемы и упругости (S.E. Little, 2012).Проводились также аллергические пробы на следующие аллергены: блоха (Ctenocephalides), клещ Tyrophagus,
клещ Acarus siro, щавель, полынь, подорожник, белая лебеда, крапива, смесь из шести трав, пыльца ржи, пыльца паритарии, пыльца латана/ивы/тополя, пыльца берёзы/ольхи/ореха, амброзия, гриб Alt.tenuis/Clad.herbarum, гриб Asp.fumigatus/Pen.notatum, клещLepidoglyphus destructor, гриб Malassezia, клещ D.pteronyssinus, клещ D.farinae.
Порядок и время проведения аллергических проб:
Для внутрикожного тестирования применяют исключительно «воздушные аллергены». За 8 недель до проведения кожных тестов отменяют инъекции кортикостероидов, за 3 недели — пероральный прием кортикостероидов, за 2 недели — все остальные препараты.
Порядок выполнения. Перед проведением аллерготестирования уточняется наименования аллергена, его серийный номер, количество PNU/мл, проверяется срок годности, герметичность флакона.
На участке внутренней поверхности кожи кошки боковой поверхности туловища проводится бритье манипуляционного поля. Далее данный участок обрабатывается дезинфицирующим раствором (70% этиловый спирт). Диагностические аллергены, 0,01% раствор гистамина, тест-контрольную жидкость набирают по отдельности в стерильные одноразовые шприцы, соблюдая правила антисептики. На обработанную антисептиком кожу наносят по 0,05 мл препарата, соблюдая интервал между отметками по 3-5 см.
Оценку внутрикожного теста осуществляют по размеруприпухлости, их гиперемии и упругости. Результаты кожного теста интерпретируются как положительные, если припухлость приобретает диаметр, равный половине средней арифметической величины диаметра волдырей негативного и позитивного контролей или больше. Оценку реакции в месте введения аллергенов осуществляют через 5–10 минут.
Обязательными условиями корректного учета результатов кожных аллергопроб являются:
- отрицательная реакция с тест-контрольной жидкостью;
- положительная реакция на 0,01% раствор гистамина.
Оценка результатов использования аллерговакцина компании Artuvet (Нидерладны) осуществляли с учетом схемы, приведенной в таблице 2.4.
Таблица 2.3 – Оценка результатов использования аллерговакцины компании Artuvet (Нидерладны)
Положительные кожные пробы позволяют с уверенностью судить о наличии аллергических болезней у кошек. Пробы также являются основой для назначения аллергенспецифической иммунотерапии (АСИТ) и формируют фактор исключения для постановки диагноза бронхиальной астмы.
Возможные побочные эффекты, которые могут возникнуть на фоне вакцинации:
— На месте инъекции может возникать гиперемия и зуд, в течение нескольких дней после инъекции. Это обычно проходит малозаметно, и не вызывает особенных беспокойств. Тем не менее, о данных симптомах следует сообщить.
— Крапивница (появление волдырей на коже) возникает редко. Данная реакция не опасно для жизни, но в таком случае, необходимо обратиться к специалисту.
— Тяжелые реакции – резко возникающая слабость, отдышка, рвота, понос.
Эффективность терапии:
— можно оценить не ранее, чем через 8-10 месяцев, в этот период, возможны клинические проявления аллергии, в связи с чем, параллельно вакцинации могут быть использованы препараты для устранения симптомов аллергии.
— при необходимости проведения каких-либо оперативных вмешательств, вакцинации и прочего необходимо сообщить лечащему врачу.
— если пропущена одна неделя инъекции по схеме, необходимо внести изменения в календарь вакцинации и продолжить лечение.
- Специфический Иммуноглобулин Е в крови определяли с применением тест-систем фирмы «ARTU» (Голландия) методом хемилюминесцентного иммуноанализа с помощью иммуноферментного анализатора SUNRISE с управлением через внешний персональный компьютер (Tecan Austria GmbH, Австрия).
Artuvetrin® Serum Test – этот серологический тест идентифицирует аллергены, которые могут быть ответственны за ОБ с аллергическим компонентом. Изучаются наиболее важные аллергены внутри и снаружи помещений. Благодаря новейшим технологиям этот тест обладает высокой специфичностью и чувствительностью.
Состав пробы: 29 наиболее важных внутренних и наружных аллергенов, включая Malassezia + 3 моноклональных антитела, полученных из рекомбинантного IgE.
- Эхокардиографию с цветным картированием и допплеровским анализом проводили на аппарате Миндрей ДС-8 (Китай)с тремя датчиками: конвексный C5-2E, линейный L14-6WE, внутриполостной V11-3WE с целью уточнения сопутствующей сердечно-сосудистой патологии(J.A. Boon, 2011).
Биохимический, иммуноферментный, ультразвуковой, рентгенологический методы исследования проведены по стандартным протоколам (A.Kranenburgetal, 2006; P. Padrid, 2004).
Животных наблюдали в течение года. У кошек всех групп оценивали проявления признаков бронхообструкции по выраженности жалоб. Они подвергались в динамике клиническому обследованию, исследованию секрета, полученного путем бронхоальвеолярного лаважа, показателей сыворотки крови, являющихся маркерами острой фазы воспаления. Клиническую эффективность терапии ОБ у кошек проводили с помощью оценки изменения средней продолжительности периодов обострения и ремиссии.
Статистический анализ данных, полученных при исследовании, проводили с использованием Microsoft Office Excel.В качестве характеристики центральной закономерности использовали среднее арифметическое(M), вариативности признаков — ошибку среднейарифметической (m). Оценку достоверности различий проводили с применением критерия Стьюдента. Различия между группами считали достоверными при р<0,05.
- Вакцина Artuvetrin Therapy
Ограниченность клинического использования в данном исследовании:
Использование аллерговакцины компании Artuvet (Нидерладны) проводится только в том случае, когда бронхиальная астма подтверждена путем использования диагностических процедур в следующем порядке:
— бронхоскопия,
— цитологическое исследование бронхоальвеолярного лаважа (бал);
— бактериологический посев на грибковую флору с определением вида и чувствительности.
Первая доза для подкожной терапии артуветрином начинается с 0,2 мл, после чего она постепенно увеличивается в течение более длительных интервалов времени до максимума 1,0 мл. Когда эта дозировка достигается через 12 недель, фиксированная доза 1,0 мл вводится ежемесячно. Аллергия — это хроническое заболевание, и каждые 10 месяцев для облегчения симптомов аллергии требуется новый флакон.
Стоимость вакцины зависит от количества аллергенов:
— 1 флакон, состоящий из 1-4 аллергенов (на 10 месяцев) стоит 107.95 евро * 1,06 %
— 1 флакон, состоящий из 5-8 аллергенов (на 10 месяцев) стоит 143 евро * 1,06 %
Стоимость транспортировки приблизительно равняется 15 евро.
Логистика равняется 3000 руб.