Введение
1. Теоретические основы клеточной инженерии
1.1. Понятие и методы клеточной инженерии
1.2. Клеточная инженерия у человека и животных
1.3. Клеточная инженерия у растений
2. Практическое использование клеточной инженерии
2.1. Клеточная инженерия в нанобиологии
2.2. Использование методов клеточной инженерии в создании биообъектов
2.3. Направления развития клеточной инженерии
Заключение
Список литературы
Введение
С давних пор человек мечтал о том, чтобы разводимые им животные были больше, выносливее и продуктивнее. Чтобы выращиваемые им сельскохозяйственные культуры вызревали в кратчайшие сроки, не поражались вредителями и болезнями, росли даже в условиях пониженных температур окружающего воздуха и отсутствия регулярных дождей.
В какой-то мере все эти планы удавалось претворить в жизнь благодаря селекции, но процесс этот весьма длительный, да и гарантии полного успеха дать никто не сможет. Кроме того, этот метод никак не поможет совместить в одном организме черты сразу нескольких видов.
Конечно, если они могут скрещиваться естественным путем, то это возможно, но в прочих случаях о требуемых наследственных качествах можно только мечтать.
Основным методом достижения таких результатов является клеточная инженерия. Наиболее детально все ее приемы отработаны на некоторых микроорганизмах. Вообще, дальнейшие возможности и перспективы данного направления попросту необъятны.
На данный момент ведутся углубленные разработки по выделению отдельных генов, которые и можно встраивать в организм. Таким образом, можно будет создавать домашних животных и растения, которые бы обладали строго определенным набором признаков и имели требуемый внешний вид.
Цель данной работы – рассмотреть более подробно применение клеточной инженерии и ее методы.
Задачи исследования:
— рассмотреть понятие и методы клеточной инженерии;
— изучить клеточную инженерию у человека, животных и растений;
— рассмотреть практическое использование клеточной инженерии;
— изучить направления развития клеточной инженерии.
Объект исследования – клеточная инженерия.
Предмет исследования методы и применение клеточной инженерии.
Для написания курсовой работы использовались работы наикрупнейших мыслителей, учебная и справочная литература, и также итоги фактических изучений представительных российских и иностранных писателей.
Основными авторы, в научных произведениях которых рассматривалась проблема исследования являются Князьков И.Е., Кильчевский А.В., Анохина В.С., Урбанович О.Ю. и другие.
Курсовая работа состоит из введения, двух глав, заключения и списка литературы.
1.Теоретические основы клеточной инженерии
1.1.Понятие и методы клеточной инженерии
Под клеточной инженерией понимают метод конструирования клеток нового типа на основе их культивирования, гибридизации и реконструкции.
Культура клеток — метод сохранения жизнеспособности клеток вне организма в искусственно созданных условиях жидкой или плотной питательных сред. Использование культуры клеток начато в 50-е годы нашего столетия, когда была показана возможность выращивания вирусов в культивируемых клетках. Затем развитие вирусологии и методов культивирования клеток животных и человека позволило ученым приступить к созданию вирусных вакцин.
Для культивирования могут быть использованы клетки опухолевых тканей, клетки различных органов, лимфоциты, фибро-бласты, эмбрионы, клетки почек животных и человека, раковые клетки человека и т. д. Культуры, приготовленные непосредственно из тканей организма, называются первичными. В большинстве случаев клетки первичной культуры можно перенести из культуральной чашки и использовать для получения вторичных культур, которые можно последовательно перевивать в течение недель и месяцев.
Многие клетки при этом сохраняют признаки дифференцировки тех тканей, из которых они были получены. Например, фибробласты продолжают секретировать коллаген, клетки скелетных мышц эмбриона сливаются и образуют гигантские мышечные волокна, которые спонтанно сокращаются в чашке для культуры тканей, и т. д. Так как все это происходит в культуре, то является доступным для изучения с помощью приемов, которые неприемлемы при работе с интактными тканями.
Клетки животных и человека выращивают на специальных средах в виде суспензии или монослоя на стекле. Технология культивирования некоторых клеток животных настолько хорошо отработана, что может быть использована в производственных целях для получения различных продуктов. В настоящее время клонировано много генов, кодирующих синтез белков разной биологической ценности. Некоторые из таких генов удалось перенести в клетки животных, и они стали продуцентами биологически активных белков.
В промышленных масштабах в биореакторах с использованием клеток животных налажено производство таких белков. Они используются как медицинские препараты. Например, эритропоэтин (гормон, стимулирующий образование красных кровяных тел), активатор плазминогена (используется для предотвращения образования тромбов), фактор свертывания крови III (используется при гемофилии), инсулин (для лечения диабета), поверхностный белок вируса гепатита В, интерлейкины и др. [15] Клеточная инженерия– способ создания новых объектов – технология обмена фрагментов ДНК, участками хромосом ( у прокариот ) или любыми участками (у эукариот ), независимо от того, где этот организм стоит в эволюционном плане.
Основной задачей клеточной инженерии является конструирование новых форм растений с желаемыми признаками. Перспективный метод получения дальнеродственных гибридов основывается на новой экспериментальной технике – парасексуальной гибридизации, осуществляемой путем слияния протопластов. Исследования по соматической гибридизации, осуществляемой путем слияния протопластов. Исследования по соматической гибридизации растений идут по трем основным направлениям:
— изучение и реконструкция плазмагенов (генетический материал, локализованный вне ядра);
— исследования по гибридизации клеток филогенетически отдаленных видов растений;
— получение с помощью слияния протопластов соматических гибридов, представляющих практический интерес для селекции. [7] Клеточная инженерия осуществляет обмен генетическим материалом м/у организмами, которые в обычной жизни не вступают в половой процесс. Т.о. можно создавать межвидовые гибриды или межродовые культуры.
Техника клеточной инженерии основана на протопластировании. Протопласт – это клетка без клеточной стенки, окруженная цитоплазматической мембраной. Протопласт получают, обрабатывая клетку ферментами, которые гидролизуют полимеры в клеточной стенке.
Этапы протопластировании:
1. Получение клеток , лишенных клеточной стенки
2. Осуществляется слияние протопластов с образованием диплоидных клеток. Инкубирование диплоидных клеток с целью осуществления ломки и воссоединения хромосом в разных вариантов. Высаживание протопластов на твёрдую питательную среду, при этом часть клеток переходит в гаплоидные, которые способны размножаться и образуют колонии.
3. Исследования полученных гибридных клеток.
У прокариот клеточная стенка состоит из жесткого пептидокликана. Он поддерживает форму и защищает от перепада давления. Пептидогликан мб расщеплён с помощью гидролитических ферментов, одним из которых является фермент лизоцин.
Разрушение клеточной стенки в обычных условиях сразу же приведет к гибели бактерий из-за разности давлений, так как цитоплазматическая мембрана (ЦМ) не может защищать клетку от их перепадов. [12] Чтобы сохранить целостность ЦМ, необходимо выровнять внешнее и внутреннее давления. Для этого ферментативную обработку проводят в определённой среде. Это может быть 20% раствор сахарозы, раствор повареной соли (10%). При добавлении в среду детергента (полиэтиленгликоль) происходит объединение суспензий 2-х протопластов.
Его добавление повышает частоту слияния препаратов. Т.е., приводит к образованию диплоидных клеток. Протопласту высеивают на твёрдую питательную среду. За это время, внутри диплоидных клеток может происходить обмен фрагментами хромосом с образованием нормальных клеток, содержащие гибридные хромосомы. Для того, чтобы отличить гибридные клетки от негибридных, используется еще 1 протопласт, несущий в себе определённый маркер – ген, кодирующий синтез фермента – бетталактоза.
В твёрдую питательную среду, на которую высеивают протопласт, добавляют пенициллин и цефалоспорин.
Всем растительным клеткам присуще свойство тотипотентности (это когда отдельная клетка может развиться в целый организм). В сельском хозяйстве это дает неограниченные перспективы в экспериментах по выведению новых видов полезных человеку культур. Весьма перспективна клеточная инженерия в животноводстве. В настоящее время ученые имеют громадный опыт по накоплению и хранению соматических клеток разнообразных пород животных in vitro. Особенно это касается хранения материала в условиях низких температур. [10] Рассмотрим более подробно методы клеточной инженерии:
— Выращивание клеточных культур. Метод связан с культивированием отдельных клеток в питательных средах, где они образуют клеточные культуры. Оказалось, что клетки растений и животных, помещенных в питательную среду, содержащую все необходимые для жизнедеятельности вещества, способны делиться. Клетки растений обладают еще и свойством тотипотентности, то есть при определенных условиях они способны сформировать полноценное растение. Это дает возможность с помощью клеточных культур получать ценные вещества. Например, культура клеток женьшеня нарабатывает биологически активные вещества. С другой стороны, можно размножить эти растения в пробирках, помещая клетки в определенные питательные среды. Так можно размножать редкие и ценные растения. Это позволяет создавать безвирусные сорта картофеля и других растений.
— Гибридизация клеток. Например, разработана методика гибридизации протопластов соматических клеток. Удаляются клеточные оболочки и сливаются протопласты клеток организмов, относящихся к разным видам — картофеля и томата, яблони и вишни. Перспективно создание гибридом, при котором осуществляется гибридизация различных клеток. Например, лимфоциты, образующие антитела, гибридизируются с раковыми клетками. В результате гибридомы нарабатывают антитела, как лимфоциты, и «бессмертны», как раковые клетки. Следовательно, они обладают возможностью неограниченного размножения в культуре.
— Клонирование. Интересен метод пересадки ядер соматических клеток в яйцеклетки. Таким способом возможно клонирование животных, получение генетических копий от одного организма. В настоящее время получены клонированные лягушки, получены первые результаты клонирования млекопитающих.
— Создание химерных животных. Возможно слияние эмбрионов на ранних стадиях, таким способом были получены химерные мыши при слиянии эмбрионов белых и черных мышей, химерное животное овца-коза. [8]
1.2.Клеточная инженерия у человека и животных
Предпосылкой к развитию клеточной инженерии у человека и животных явилась разработка методов культивирования их соматических клеток на искусственных питательных средах, а также получение гибридов соматических клеток, включая межвидовые гибриды. В свою очередь, успехи в культивировании соматических клеток оказали влияние на изучение половых клеток и оплодотворение у человека и животных. Начиная с 60-х гг., в нескольких лабораториях мира были выполнены многочисленные эксперименты по пересадке ядер соматических клеток в яйцеклетки, искусственно лишенные ядер. Результаты этих экспериментов часто были противоречивы, но в целом они привели к открытию способности клеточных ядер обеспечивать нормальное развитие яйцеклеток
На основе результатов изучения развития оплодотворенных яйцеклеток в 60-е гг. были начаты также исследования по выяснению возможности оплодотворения яйцеклеток вне организма матери. Очень быстро эти исследования привели к открытию возможности оплодотворения яйцеклеток сперматозоидами в пробирке и дальнейшего развития образованных таким путем зародышей при имплантации их в матку женщины. Дальнейшее совершенствование разработанных в этой области методов привело к тому, что рождение «пробирочных» детей стало реальностью. Уже к 1981 г. в мире было рождено 12 детей, жизнь которым была дана в лаборатории, в пробирке.
В настоящее время этот раздел клеточной инженерии получил большое распространение, а количество «пробирочных» детей составляет уже десятки тысяч. В нашей стране работы по получению «пробирочных» детей были начаты в 1986 г. В 1993 году была разработана методика получения монозиготных близнецов человека in vitro, путем разделения эмбрионов на бластомеры и доращивания последних до 32 клеток, после чего они могли быть имплантированы в матку женщины. [4] Под влиянием результатов, связанных с получением «пробирочных» детей, у животных тоже была разработана технология, получившая название трансплантации эмбрионов. Она связана с разработкой способа индукции полиовуляции, способов искусственного оплодотворения яйцеклеток и имплантации зародышей в организм животных — приемных матерей.
Суть этой технологии сводится к следующему. Высокопродуктивной корове вводят гормоны, в результате чего наступает полиовуляция, заключающаяся в созревании сразу 10-20 клеток. Затем яйцеклетки искусственно оплодотворяются мужскими половыми клетками в яйцеводе. На 7-8-й день зародышей вымывают из матки и трансплантируют в матки другим коровам (приемным матерям), которые затем дают жизнь телятам-близнецам. Телята наследуют генетический статус своих подлинных родителей.
Другой областью клеточной инженерии у животных является получение трансгенных животных. Наиболее простой способ получения таких животных заключается во введении в яйцеклетки исходных животных линейных молекул ДНК. Животные, развившиеся из оплодотворенных таким образом яйцеклеток, будут содержать в одной из своих хромосом копию введенного гена. Больше того, они и будут передавать этот ген по наследству. Более сложный способ получения трансгенных животных разработан на мышах, различающихся по окраске шерстного покрова и сводится к следующему. Вначале из организма беременной серой мыши извлекают четырехдневных зародышей и измельчают их на отдельные клетки. [3] Затем из эмбриональных клеток извлекают ядра, переносят их в яйцеклетки черных мышей, предварительно лишенные ядер. Яйцеклетки черных мышей, содержащие чужие ядра, помещают в пробирки с питательным раствором для дальнейшего развития. Развившиеся из яйцеклетки черных мышей зародыши имплантируют в матки белых мышей. В выполненных по этой методике экспериментах от пяти белых мышей («приемных матерей») было получено 36 мышей, среди которых трое были серыми. Таким образом, в этих экспериментах удалось получить клон мышей с серой окраской шерстного покрова, т.е. клонировать эмбриональные клетки с заданными свойствами.
Так рассмотрели результаты оплодотворения искусственно лишенных ядер яйцеклеток овец ядерным материалом соматических клеток животных этого же вида. В частности, из яйцеклеток овец удаляли ядра, а затем в такие яйцеклетки вводили ядра соматических клеток (эмбриональных, плодовых или клеток взрослых животных), после чего оплодотворенные таким образом яйцеклетки вводят в матки взрослых овец. Рождающиеся ягнята оказались идентичными овце-донору. Такое получение трансгенных животных представляет собой прямой путь клонирования животных с хозяйственно-полезными признаками, включая особей определенного пола. [4] Трансгенные животные получены также при использовании исходного материала, принадлежащего разным видам, в частности, известен способ передачи гена, контролирующего гормон роста, от крыс в яйцеклетки мышей, а также способ комбинирования бластомеров овцы с бластомерами козы, что привело к получению гибридных животных (ковец). Эти эксперименты указывают на возможность преодоления видовой несовместимости на самых ранних этапах развития. Особенно заманчивые перспективы открываются (если видовая несовместимость будет преодолена полностью) на пути оплодотворения яйцеклеток одного вида ядрами соматических клеток другого вида. Речь идет о реальной перспективе получения хозяйственно-ценных гибридов животных, которых невозможно получить путем скрещиваний.
Следует отметить, что ядерно-трансплантационные работы еще не очень эффективны. Эксперименты, выполненные на земноводных и млекопитающих, в целом показали, что их результативность является небольшой, причем она зависит от несовместимости между донорскими ядрами и реципиентными овоцитами. Кроме того, препятствием на пути к успехам являются также образующиеся хромосомные аберрации в трансплантированных ядрах в ходе дальнейшего развития, которые сопровождаются гибелью трансгенных животных. [11] На стыке работ по изучению гибридизации клеток и иммунологических исследований возникла проблематика, связанная с получением и изучением так называемых моноклональных антител. Антитела, продуцируемые организмом в ответ на введение антигена (бактерии, вирусы, эритроциты и т.д.), представляют собой белки, называемые иммуноглобулинами и составляющие фундаментальную часть защитной системы организма против возбудителей болезней. Но любое чужеродное тело, вводимое в организм, представляет собой смесь разных антигенов, которые будут возбуждать продукцию разных антител. Например, эритроциты человека обладают антигенами не только для групп крови А (II) и В (III), но и многими другими антигенами, включая резус-фактор.
Далее, белки клеточной стенки бактерий или капсида вирусов также могут действовать в качестве разных антигенов, вызывающих образование разных антител. В то же время лимфоидные клетки иммунной системы организма обычно представлены клонами. Значит, даже только по этой причине в сыворотке крови иммунизированных животных антитела всегда представляют собой смесь, состоящую из антител, продуцируемых клетками разных клонов. Между тем для практических потребностей необходимы антитела только одного типа, т.е. необходимы так называемые моноспецифические сыворотки, содержащие антитела только одного типа, или, как их называют, моноклональные антитела.
В поисках методов получения моноклональных антител швейцарскими исследователями в 1975 г. был открыт способ получения гибридов между лимфоцитами мышей, иммунизированных тем или иным антигеном, и культивируемыми опухолевыми клетками костного мозга. Такие гибриды получили название «гибридомы». От «лимфоцитарной» части, представленной лимфоцитом одного клона, одиночная гибридома наследует способность вызывать образование необходимых антител, причем одного типа, а благодаря «опухолевой (миеломной)» части она становится способной, как и все опухолевые клетки, бесконечно долго размножаться на искусственных питательных средах, давая многочисленную популяцию гибридом.
Линии мышиных клеток, синтезирующих моноклональные антитела, выделяют путем слияния миеломных клеток с лимфоцитами из селезенки мыши, иммунизированной за пять дней до этого желаемым антигеном. Слияние клеток достигают смешиванием их в присутствии полиэтиленгликоля, который индуцирует слияние клеточных мембран, а затем в высеве их на питательную среду, позволяющую рост и размножение только гибридных клеток (гибридом). Размножение гибридомы разводят в жидкой среде, где они растут далее и секретируют антитела в культуральную жидкость, причем только одного типа, к тому же в неограниченных количествах. Эти антитела получили название моноклональных. [23] Чтобы повысить частоту образования антител, прибегают к клонированию гибридом, т.е. к селекции отдельных колоний гибридом, способных вызывать образование наибольшего количества антител желаемого типа. Моноклональные антитела нашли широкое применение в медицине для диагностики и лечения ряда болезней В то же время важнейшее преимущество моноклональной технологии заключается в том, что с ее помощью могут быть получены антитела против материалов, которые невозможно очистить. Напротив, можно получить моноклональные антитела против клеточных (плазматических) мембран нейронов животных. Для этого мышей иммунизируют выделенными мембранами нейронов, после чего их селезеночные лимфоциты объединяют с миеломными клетками, а дальше поступают, как описано выше.
1.3.Клеточная инженерия у растений
Клеточная инженерия у растений заключается в получении растений из одной клетки, а также в генетических манипуляциях с изолированными клетками, направленными на преобразование их генотипов.
Метод получения растений из одной клетки основан на способности тканей растений ряда видов к неорганическому росту на специальных искусственных средах, содержащих питательные вещества и регуляторы роста. При культивировании тканей растений на таких средах многие клетки оказываются способными к неограниченному размножению, образуя слои (массу) недифференцированных клеток, получивших название каллуса. Если затем каллус разделить на отдельные клетки и продолжить культивирование изолированных клеток на питательных средах, то из отдельных (одиночных) клеток могут развиться настоящие растения. [8] Способность одиночных соматических клеток растений развиваться в настоящее (целое) растение, называют тотипотентностыо. Возможно, тотипотентность присуща клеткам всех листостебельных растений. Но пока она обнаружена у растений ограниченного круга. В частности, эта способность обнаружена у клеток картофеля, моркови, табака и ряда других видов сельскохозяйственных культур. Этот метод клеточной инженерии растений уже вошел в широкую практику.
Однако растения, развившиеся из одной клетки, характеризуются генетической нестабильностью, что связано с мутациями их хромосом. Поскольку генетическая нестабильность дает разнообразные формы растений, они очень полезны в качестве исходного материала для селекции.
Однако растения можно получить и из так называемых протопластов растительных клеток, под которыми понимают клетки, у которых искусственно с помощью гидролитических ферментов (пектиназы и целлюлазы) удалена клеточная стенка. Обычно протопласты получают из клеток листьев, корней, лепестков, прорастающей пыльцы, плодов и других структур растений. Способность протопластов давать начало растениям выявлена у очень большого количества видов.
Получение растений из одной клетки или протопласта часто называют клональным микроразмножением. Главнейшее преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет резко сократить сроки размножения многих видов растений, а также очень быстро воспроизвести одно и то же растение в сотнях тысяч экземпляров, что имеет исключительно важное значение в селекционной работе и в получении посадочного материала, незараженного возбудителями болезней
Генетические манипуляции, связанные с растительными клетками, направлены на преобразование генотипов клеток растений, что достигают либо путем соматической гибридизации (получения гибридных клеток) либо путем переноса в клетки генетического материала, происходящего от других организмов. Во всех случаях исходным материалом являются протопласты клеток. [10] Соматическую гибридизацию осуществляют в несколько этапов, а именно:
1. Получение и слияние протопластов, происходящих от клеток растений разных видов.
2. Культивирование гибридных протопластов, используя селективные питательные среды.
3. Регенерация растений из соматических гибридов (гибридов протопластов) через образование последними каллуса.
Перенос генетического материала от одних клеток к другим осуществляют путем трансформации протопластов чужеродной ДНК либо введением в протопласты чужеродной ДНК с помощью плазмид. Из образующегося затем каллуса выращивают растения, содержащие интересующий ген. Растения, полученные таким путем, называют трансгенными растениями.
2.Практическое использование клеточной инженерии
2.1.Клеточная инженерия в нанобиологии
Одно из направлений развития нанобиотехнологии связано с клеточной инженерией. Культура растительных клеток может служить, прежде всего, источником свойственных данному растению вторичных продуктов. Пользуясь способностью клеток растений превращаться на специальных средах в сформированное растение, клеточные культуры применяют для получения безвирусных растений, пытаются проводить селекцию форм нужными свойствами. Клетки животных более требовательны к условиям культивирования, им необходимы дорогостоящие среды. Все более широкое применение находят так называемые гибридомы, служащие источником белков, необходимых для диагностики и лечения болезней человека, животных и растений. [1] В настоящее время нанобиотехнология становится основой крупного промышленного производства. Исследования по генной инженерии и получению новых материалов все более актуальны. Это, например, относится к применению растениеводческой продукции в качестве биотоплива. Предполагается, что в ближайшем будущем разработки нанобиоиндустрии будут востребованы еще больше.
В связи с ростом населения в мире сельскому хозяйству предстоит не только увеличить продуктивность, но и уменьшить потери урожая в процессе уборки, послеуборочной обработки и хранения. Нанобиотехнология может внести существенный вклад в улучшения питания, сопротивляемости культур неблагоприятным погодным условиям, а также болезням и вредителям.
Свойства промышленного и сельскохозяйственного сырья на наноразмерном уровне позволят существенно сократить энергоемкость производства единицы продукции, повысить надежность, сроки службы, автоматизировать и внедрить компьютерную технологию в установки и приборы экспресс-контроля и определения качества пищевой продукции, лечения и удлинения продуктивной деятельности биообъектов.
В настоящее время большой интерес представляют так называемые наноэлектротехнологии, т.е. биологические и физиологические процессы, осуществленные с помощью наноэлектрочастиц (электронов, протонов, ионов, фотонов) на уровне живых клеток и микроорганизмов. [7] Под термином «наноэлектротехнология» понимаются электрофизические воздействия оптического излучения ультрафиолетового (УФ) диапазона на сельскохозяйственные объекты и их составные элементы на уровне биоклеток и их структур.
К УФ излучению относится часть оптической области спектра с длинами волн от 11 до 400 нм, которые обладают наибольшей энергетической активностью по сравнению с видимыми и инфракрасным (ИК) излучением. Исследованиями воздействия УФ излучения на организм животных и растений установлено выраженное разностороннее биологическое действие как естественного, так и искусственного излучения.
Фитобиологические реакции независимо от того, в каком объекте они протекают, разделяются на две группы: функционально-физиологические и деструктивно-одифицирующие.
В научных коллективах агропромышленного профиля разработано и обосновано боле 110 энергосберегающих наноэлектротехнологий, в том числе с использованием электромагнитных полей сверхвысоких частот (ЭМП СВЧ), оптических и ультразвуковых излучений, электрических зарядов и импульсов, элекроаэрозолей и ионов.
Интерес к нанотехнологиям обусловлен тем, что при воздействии на наноуровне материалы и объекты изменяют свою структуру и преобретают некоторые превосходные свойства, включая химические, электрические и оптические. Перспективными направлениями применения нанотехнологий и наноматериалов в сельском хозяйстве могут быть следующие:
— Нанороботы (сравнимы по размерам с кровяными клетками или даже меньше их) способны исследовать каждый капилляр. Они поддаются управлению при проведении диагностических операций. Путем применения высокоскоростных беспроводных средств коммуникации нанороботы могут быть объединены в сеть с другими компьютерами, а также образовывать базы данных исследуемых объектов.
— Наноустройства, которые могут имплантироваться в растения, животные, позволяют получать и передавать в реальном времени данные о скорости роста и других физиологических характеристиках, обеспечивают определение структуры и продуктивности исследуемых объектов, состояния окружающей среды, а также уровней химических и физических рисков. [20] Ключевой особенностью биологических наноструктур является способность к распознаванию на молекулярном уровне, которая играет очень важную роль в процессах самосборки атомных и молекулярных структур. Процесс самосборки имеет две характерные особенности: молекулы обладают высокой аффинностью по отношению друг к другу, а в результате образования связей формируется структура с предсказуемыми свойствами. Ученые, которые стремятся создавать определенные наноструктуры, предпочли бы имитировать подобные механизмы сборки. Вместо того чтобы «спускаться» с макроскопического уровня, используя все более точные и дорогостоящие инструменты, удобнее было бы создавать наноконструкции «снизу вверх», начиная с химических систем.
Одно из преимуществ конструирования «снизу вверх» — огромное химическое разнообразие. Поскольку на поверхности компонентов клетки на единицу площади приходится множество функциональных групп, то в качестве строительного блока можно использовать всю эту сложную в химическом отношении поверхность. В принципе, возможно, менять положение и ориентацию такого блока. Конструирование «сверху вниз», напротив, основано на материалах с небольшим химическим разнообразием.
Другое преимущество – значительные количества вещества, с которыми приходится иметь дело на химическом уровне. Всего 1 пмоль вещества содержит 1112 молекул. Компонент, который с наибольшим успехом применяется в экспериментах по имитации биологической самосборки – ДНК.
Обеспечение населения безопасными продуктами питания при минимальном загрязнении окружающей среды – основа выживания человечества. В этом аспекте роль нанотехнологий в сельском хозяйстве развитых и развивающихся стран, вероятно, будет доминирующей. [19]
2.2.Использование методов клеточной инженерии в создании биообъектов
Клеточная инженерия — «насильственный» обмен участками хромосом у прокариот или участками и даже целыми хромосомами у эукариот. В результате создаются неприродные биообъекты, среди которых могут быть отобраны продуценты новых веществ или организмы с ценными в практическом отношении свойствами.
Перспективы клеточной инженерии заключаются прежде всего в том, что с ее помощью возможно получение межвидовых и межродовых гибридных культур микроорганизмов, а также гибридных клеток между отдаленными в эволюционном отношении многоклеточными организмами.
Первый этап работы связан с удалением у микроорганизмов клеточной стенки.
Пептидогликан клеточной стенки может быть расщеплен с помощью ферментов (гидролаз пептидогликана), из которых самым известным является лизоцим. [16] Удалить клеточную стенку и в тоже время сохранить целостность мембраны протопласта можно, лишь выровняв осмотическое давление внутри клетки и в среде.
При протопластировании: для получения протопластов клеточную стенку удаляют ферментативной обработкой в «гипертонической» среде с 20 % раствором сахарозы или маннита, иногда с 10 % раствором натрия хлорида в зависимости от определенных особенностей биообъекта и преследуемых целей.
Если биообъект принадлежит к микроскопическим (плесневым и дрожжевым) грибам, то для получения протопластов используют, как правило, не лизоцим, а комплексный ферментный препарат, выделенный из пищеварительного тракта виноградной улитки. Связано это с тем, что состав клеточной стенки у грибов более сложен, чем у бактерий.
Следующий этап работы состоит в объединении суспензий двух образцов протопластов, принадлежащих разным штаммам или разным видам, в более редких случаях — даже разным родам. Частота слияния резко повышается при добавлении к протопластам полиэтиленгликоля, обладающего свойствами детергента.
Культуры таких клеток обладают новыми свойствами. В качестве примера можно привести получение «гибридных» антибиотиков.
Известно, что среди актиномицетов есть принадлежащие к разным видам продуценты антибиотиков гликозидной структуры с варьирующими агликонами и сахарами. Так, антибиотик эритромицин имеет 14-членный макроциклический агликон и два сахара (дезозамин и кладинозу), присоединенных к нему гликозидной связью, а у антибиотиков — антрациклинов агликон состоит из четырех сконденсированных углеродных шестичленных колец, соединенных с аминосахаром. [21] С помощью клеточной инженерии были получены продуценты таких антибиотиков, у которых макролидный агликон эритромицина был связан с углеводной частью, соответствующей антрациклинам, и наоборот, антрациклиновый агликон с сахарами, свойственными эритромицину.
2.3.Направления развития клеточной инженерии
Молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот. Применяют как ДНК-ДНК, так и ДНК-РНК-гибридизацию. Степень молекулярной гибридизуемости используется для характеристики систематического и филогенетического родства видов. Метод молекулярной гибридизации перспективен при изучении природы парасексуальных гибридов, особенно гибридов филогенетически отдаленных видов. В случае, когда хромосомный анализ не в состоянии выявить наличие в клетках гибридов хромосомного материала одного из родителей, наиболее подходящим методом для анализа гибридов является именно метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот.
Фенотипическая изменчивость, наблюдаемая у соматических гибридов, является отражением тех генетических явлений, которые происходят до регенерации и указывают на следующие 4 источника изменчивости:
1) ядерная несовместимость;
2) межгеномная митотическая рекомбинация;
3) сомаклональная изменчивость;
4) органоидное расщепление. [12] Существуют следующие ограничения, мешающие полному успеху метода соматической гибридизации:
1) применение этого метода требует эффективной регенерации растений из протопластов;
2) соматические гибриды не поддаются половому размножению, все межвидовые соматические гибриды являются стерильными;
3) для того, чтобы перенести полезные гены из диких видов в культурные, необходимо осуществить межгеномную рекомбинацию или хромосомные замещения между двумя видами;
4) при слиянии протопластов получаются растения с суммированным числом хромосом. Однако быстрый прогресс в совершенствовании методов клеточной инженерии позволяет надеяться, что соматическая гибридизация как новая биотехнология станет основной в селекции для получения жизнеспособных гибридов нескрещивающихся видов растений.
Реконструкция клетки является еще одним бурно развивающимся направлением клеточной инженерии. Речь идет о сборке совершенно новой клетки за счет объединения (слияния) изолированных клеточных фрагментов друг с другом или с целыми клетками. В результате такой реконструкции можно создать клетку, ранее в природе не существовавшую. Однако многие проблемы, стоящие на пути исследований в данном направлении, связаны с ограниченным числом подходящих методик фрагментации и выделения гомогенных популяций интактных клеточных фрагментов.
Существует ряд методик по введению чужеродных хлоропластов в изолированные протопласты. Одна из методик предусматривает последовательное центрифугирование протопластов и пластид в 0,03% растворе лизоцима, который обладает модифицирующим действием на мембрану. Частота проникновения чужеродных органелл в протопласты в данном случае составляет 0,5%. Другой метод заключается в том, что изолированные одиночные клетки инкубируют с ферментом целлюлазой. После появления первых протопластов клетки переносят в суспензию хлоропластов в 2% растворе целлюлазы и 0,2 М NaNo3при рН 5,4. [19] С помощью этого метода проведено успешное включение в протопласты функционально активных хлоропластов с дальнейшей регенерацией целых растений. Осуществлена пересадка пластид черного паслена, несущих гены, контролирующие устойчивость к атразину, культурному картофелю. Анализ хлоропластной ДНК устойчивых к атразину растений-регенерантов картофеля показал, что хлоропласты этих линий произошли от паслена.
Перенос высокоэффективных хлоропластов может способствовать активации фотосинтеза и повышению продуктивности растений. Среди большого разнообразия генетически измененных форм растений, образовавшихся из слившихся протопластов, встречаются формы, содержащие пластиды одного родителя, а митохондрии другого, и наоборот.
Новым направлением клеточной инженерии растений является создание необычных биологических систем путем введения микрорганизмов в популяцию культивируемых клеток. Создание таких ассоциаций представляет интерес для решения следующих задач:
1) экспериментальной проверки теории эндосимбиотического происхождения эукариотической клетки в процессе эволюции;
2) моделирования природных симбиотических отношений растений микроорганизмов;
3) повышения продуктивности культивируемых растительных клеток;
4) получения растений с новыми свойствами;
5) изучения различных аспектов взаимодействия растения-хозяина и патогена. [5] Получение искусственных ассоциаций межклеточного и внутриклеточного типа на основе культивируемых клеток или изолированных протопластов с микроорганизмами является одним из новых способов модификации растительной клетки. Довольно перспективным является получение ассоциаций культур клеток растений с микроорганизмами, способными к фиксации молекулярного азота атмосферы. Способность к формированию азотфиксирующих симбиотических систем приобрели определенные группы высших растений и микроорганизмов . В связи с этим вопрос о повышении способности к вступлению в такие симбиотические ассоциации для большинства растений имеет важное экономические значение и может быть решен методами клеточной инженерии.
Следовательно, становится возможным конструирование клеток с новыми свойствами. Реконструированные клетки, происходящие из ядра и цитоплазмы разного происхождения, являются удобными экспериментальными моделями для решения таких важных биологических проблем, как дифференцировка, старение клеток, цитоплазматическая наследственность. Гибриды растений с генетически реконструированной цитоплазмой представляют собой весьма ценный материал для оценки влияния двух цитоплазматических генофоров на различные практически значимые признаки возделываемых культур.
Заключение
Подводя итог можно сказать, что клеточная инженерия – одно из наиболее важных направлений в биотехнологии. Она основана на использовании принципиально нового объекта – изолированной культуры клеток или тканей эукариотических организмов, а также на тотипотентности – уникальном свойстве растительных клеток. Применение этого объекта раскрыло большие возможности в решении глобальных теоретических и практических задач. В области фундаментальных наук стало осуществимым исследование таких сложных проблем, как взаимодействие клеток в тканях.
Клеточная дифференцировка, морфогенез, реализация тотепотентности клеток, механизмы появления раковых клеток и др. при решении практических задач основное внимание уделяется вопросам селекции, получения значительных количеств биологически ценных метаболитов растительного происхождения, в частности более дешевых лекарств, а также выращивания оздоровленных безвирусных растений, их клонального размножения и др.
Итак, основными направления использования достижений клеточной инженерии являются:
1. В области селекции с переходом на клеточный уровень стало возможным вести клеточную и гаметную селекцию на устойчивость к биотическим и абиотическим стрессам, преодолевать барьеры нескрещиваемости и создавать принципиально новые формы, несущие различные наборы ядерных и цитоплазматических генов в результате соматической гибридизации, изменять уровень плоидности и ускорять селекционный процесс путем использования гаплоидов, сохранять генофонд в виде культуры клеток посредством криосохранения в жидком азоте. Следует также отметить, что технологии создания трансгенных растений, как правило, включают и культивирование клеток и тканей in vitro.
2. В области семеноводства создана индустрия производства оздоровленного от вирусов и других патогенов посадочного материала вегетативно размножаемых культур (картофель, плодовые, ягодные, овощные, декоративные растения)
3. В области защиты растений получены на основе достижений генной и клеточной инженерии растения, устойчивые к насекомым, вирусам, болезням, и другим патогенам; созданы новые средства защиты растений путем культивирования бактерий и грибов (антагонистов патогенов), биологически активных веществ, полученных при культивировании организмов и т.д.
4. Путем клеточной инженерии созданы новые штаммы микроорганизмов, повышающие усвоение азота и фосфора, подавляющие развитие вредной микрофлоры, что позволяет конструировать микробоценоз, достигая повышения плодородия почвы и продуктивности растения.
5. Принципиально новые возможности открываются в области защиты окружающей среды. Новые штаммы микроорганизмов позволяют решить экологически безопасным путем проблему утилизации отходов промышленности и сельского хозяйства, получая при этом энергию. Этот же подход позволяет уменьшить действие поллютантов (тяжелые металлы, нефтепродукты, пестициды и др.) на экосистемы и человека.
Создание на основе генной и клеточной инженерии растений с максимальным накоплением поллютантов позволит извлекать их из загрязненного субстрата (почва, вода), а растения с минимальным накоплением дадут возможность получать экологически безопасную продукцию.
6. Культивирование новых микроорганизмов и растений-суперпродуцентов биологически активных веществ позволит более эффективно решить проблему создания и производства новых лекарств и препаратов для медицины и ветеринарии. Важным направлением практического применения клеточной инженерии является микробиологический синтез белка и незаменимых аминокислот.
Список литературы
1.Биохимия растений / Г.-В. Хелдт ; пер. с англ.-2-е изд. (эл.). -М. : БИНОМ. Лаборатория знаний, 2014, 471 с. — ISBN 978-5-9963-1302-0.
2.Биология — еженедельное приложение к газете «Первое сентября» (№21 1998)
3.Биология. В 2 кн. (Учебник) Под ред. В.Н. Ярыгина, 2013, 5-е изд., 432с.,
4.Биология с основами экологии. (Учебник) Пехов А.П. 2014.
5.Большой энциклопедический словарь. – 2-е изд., перераб. И доп. – М.: Большая Российская энциклопедия, 2018, — 1456 с.
6.Викторов В.П., Черняева Е.В. Интродукция растений; М.: Прометей, 2014, 152 c., — ISBN 978-5-7042-2409-9
7.Генетические основы селекции растений. Частная генетика растений. Том 2, монография/ Кильчевский А.В. [и др.] Минск: Белорусская наука, 2013, 579 c. ISBN 978-985-08-1127-1
8.Генетические основы селекции растений. Том 3. Биотехнология в селекции растений. Клеточная инженерия/ Анохина В.С. [и др.] Минск: Белорусская наука, 2012, 490 c. ISBN 978-985-08-1392-383
9.Генетические основы селекции растений. Том 4. Биотехнология в селекции растений. Геномика и генетич. инженерия/ Урбанович О.Ю. [и др.]. Минск: Белорусская наука, 654 c. ISBN 978-985-08-1791-4
10.Гистология, эмбриология, цитология : учебник / Н. В. Бойчук, Р. Р. Исламов, Э. Г. Улумбеков, Ю. А. Челышев ; под ред. Э. Г. Улумбекова, Ю. А. Челышева. — 4-е изд. перераб. и доп. — М. : ГЭОТАР-Медиа, 2016. 944 с. — ISBN 978-5-9704-3782-7.
11.Егорова, Клунова, Живухина. Основы биотехнологии; М. 2013.
12.Жакирова Н.К., Байзолданов Т.Б., Сакипова З.Б. Основы фармацевтической биотехнологии, Уч. пособие, Алматы КазНМУ,Эверо, 2015 – 223 с.
13.Кузнецов Вл.В. Физиология растений: Учебник / Вл.В. Кузнецов, Г.А. Дмитриева. — М.: Абрис, 2012, 783 с.: — ISBN 978-5-4372-0046-9.
14.Князьков И.Е. Клеточная инженерия растений: учебное пособие/И.Е. Князьков, О.Н. Сахно; Мин-во образ. и науки РФ; Владимирский гос. Университет, — Владимир, «Аркаим», 2016, — 84 с.
15.Методы культивирования клеток: сборник трудов, под ред. Г.П. Пинаева/ Л.: Ленинградское отд. «Наука», 1988, 320 с., ISBN 5-02-026610-8
16.Микробиология. (Учебник) Гусев М.В., Минеева Л.А. 2013, 464с
17.Муромцев Г. С., Бутенко Р. Г., Тихоненко Т. И. и др. Основы сельскохозяйственной биотехнологии. М., 2014.
18.Наглядная биотехнология и генетическая инженерия/ Р. Шмид ; пер. с нем.-2-е изд.; М. : БИНОМ. Лаборатория знаний, 2015, 327 с., — ISBN 978-5-9963-2407-1.
19.Основы сельскохозяйственной биотехнологии/ Муромцев Г.С., Бутенко Р.Г., Тихонович Т.И. и др.,М.: Агропромиздат, 1990, 384 с.,
20.Патофизиология сельскохозяйственных культур: учебное пособие. — Москва : РГ-Пресс, 2016, 304 с. — ISBN 978-5-9988-0433-5.
21.Пирузян Э.С., Основы генетической инженерии растений/ М.: Знание, 1988, с. 68, IB – 9163, — 4107000000
22.Сельскохозяйственная биотехнология: учебник/ под ред. Академика РАСХН В.С Шевелухи, 3-е изд., М.: «Высшая школа», 2008, 712 с., ISBN 978-5-06-004264-1.
23.Фармацевтическая биотехнология : рук. к практ. занятиям : учеб. пособие / С.Н. орехов ; под ред. В.А. Быкова, А.В. катлинского. – м.: ГЭОТАР-Медиа, 2016. – С. 7-21.
24.Физиология и биохимия сельскохозяйственных растений / Н.Н. Третьяков, Е.И. Кошкин, Н.М. Макрушин и др.; Под ред. Н.Н. Третьякова. — 2-е изд. — М.: КолосС, 2013, 656 с. — ISBN 5-9532-0185-0.
25.Шевелуха В.С., Калашникова В.А.; под ред. В.С. Шевелухи. Сельскохозяйственная биотехнология. М.: Высшая школа. 2013г.