Реактивные изменения поведения крыс в динамике эстрального цикла.

Страницы: 1 2

---

Содержание

 

• Введение
• Глава 1. Обзор литературы
• 1.1 Морфофункциональные изменения женской репродуктивной системы
• 1.2 Понятие эстрального цикла и его этапы
• 1.3 Эстральный цикл у крыс
• 1.4 Поведенческие эффекты женских половых гормонов
• 1.5 Поведенческие особенности крыс линии WAG/Rij
• Глава 2. Материал и методы исследования
• 2.1 Объекты исследования
• 2.2 Методы исследования
• Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение
• 3.1 Изучение эстрального цикла методом влагалищных мазков
• 3.2 Исследование уровня тревожности крыс в зависимости от эстрального цикла
• 3.3 Оценка уровня депрессивности самок крыс в зависимости от эстрального цикла
• 3.4 Оценка когнитивного поведения самок крыс в зависимости от эстрального цикла
• Выводы
• Список использованной литературы

 

Введение

 

В последние годы поведенческие особенности животных привлекают все внимание исследователей и ученых самых различных профессий.Институты физиологии и психологии исследуют поведение человека и животных с помощью разнообразных методов и подходов.Исследователям-зоологам при работе по систематике, исследований по ориентации и адаптации животных необходимо изучение поведения животного мира. При одомашнивании и содержании животноводами сельскохозяйственных животных необходима роль поведенческих особенностей. Кроме того, исследование поведения животных играет важную роль в развитии бионики[35].

Известно, что поведение — это физиологический процесс, представляющий собой адаптивную связь между организмом и окружающей средой. Ответная реакция организма изменяется в связи с изменением среды потому, что организмы взаимодействуют с живой или неживой окружающей средой. Поведение, как мы понимаем, это активные изменения или направленные действия, которые способствуют выживанию[18]. По литературным данным, эстрогены и прогестерон выполняют функцию, которая отвечает за контроль полового поведения.Как писал Бич, поведение самок значительно сложный процесс и его необходимо рассмотреть его в целом[41].

Теоретическую модель, предложенная Лешнером из обзора многочисленных исследований гормонов и агрессивного поведения, учитывает гормональный статус организма, влияние окружающей среды, развитие и свойства самого животного как объекта, вызывающего агрессивную реакцию [51].

Результаты, полученные в различных условиях на крысах разных линий (Wistar, Sprague-Dawley, Long-Evans, Fisher 344, WAG/Rij, SHR и др.), показывают существование определенной зависимости поведения от стадии эстрального цикла, что связывается с циклическими изменениями концентрации половых стероидов в плазме и в ткани мозга [11].

Поскольку, железы внутренней секреции и нервная система имеют общие функции коммуникации и координации внутри организма следует обратить внимание на взаимодействие половых гормонов и поведенческих особенностей. Гормоны, которые циркулируют в крови, часто рассматриваются как первичные мотивирующие факторы поведения животных, а измененный их уровень внутренними и внешними факторами отражается на особенностях поведения. Работы, посвященные ориентировочно-исследовательской деятельности занимают основное место в психофизиологических исследованиях. Однако воздействие гормональных факторов на высшие функции головного мозга неоднозначно и характеризуется множественностью физиологических эффектов. Поэтому в настоящее время построение модели, которая отражала бы зависимость между уровнем гормонов в организме и его влиянием на высшие функции мозга, представляется актуальным [35].

Исходя из вышеизложенного,целью работы стало исследование поведенческих особенностей крыс линий Wistar и WAG/Rij в зависимости от стадии эстрального цикла.

В соответствии с целью исследования, были были поставлены следующие задачи:

1. Определить регулярность половых циклов у самок крыс линии Wistarи WAG/Rij.
2. 2.Выявить уровни тревожности в динамике эстрального цикла у самок крыс линии Wistar и WAG/Rij.
3. Исследовать уровень депрессивности в динамике эстрального цикла у самок крыс линии Wistarи WAG/Rij.
4. Изучить нарушения когнитивных функций у самок крыс линии Wistarи WAG/Rijв динамике эстрального цикла.

 

Глава 1. Обзор литературы

 

1.1 Морфофункциональные изменения женской репродуктивной сֺиֺсֺтֺеֺмֺы

 

Яичники – это парный орган, который выполняет эндокринную (продукция половых гормонов) и репродуктивную (формирование женских половых клеток) функции. Они расположены асимметрично на заднем листке широкой связки в малом тазу и прикреплены нижним краем к короткой части мезовария. Укаждого яичника имеется две связки: собственная связкая ичника связывает яичник с маткой, которая заканчивается несколько ниже и позади маточной трубы и воронко-тазовая связка, которая направляется к боковой стенки таза от верхнего полюса яичника. В них и через мезоварий проходит основная часть нервов, лимфатических и кровеносных сосудов[44].
У яичника функционирование цикличное и, поэтому, его строение зависит от наличия беременности или от стадии эстрального цикла[26].

С наружней стороны, кроме области ворот, яичник покрыт эпителием, которого именуют по-разному покровной, поверхностный, зачатковый, или герминативный [13].

С поверхности яичник окружен плотной волокнистой соединительной тканью — белочной оболочкой, покрытой мезотелием. Остальная часть поверхности мезотелия обеспечена микроворсинками[4].

Яичник состоит из коркового и мозгового вещества. Корковое вещество расположено на периферии яичника и характеризуется наличием овариальных фолликулов. Мозговое вещество свободно от фолликулов и находится посередине яичника. В нем располагаются крупные органные сосуды, распадающиеся на более мелкие и, уходящие в корковое вещество,ветви. Специализированная рыхлая волокнистая соединительная ткань -стромальная часть этих веществ яичника и представляет собой производную мезенхимы[14].

Соединительнотканная строма является основой обоих веществ. В корковом веществе она представлена из межклеточного вещества и лежащих плотно фибробластов, а в мозговом веществе состоит из большого количества неупорядоченных эластических волокон, гладкомышечных клеток и огромного числа кровеносных сосудов. И преобладающая часть кровеносных сосудов сосредоточена в этом веществе [1,14].

Толщина коркового вещества постепенно возрастает от рождения до репродуктивного периода онтогенеза, а потом медленным темпом уменьшается. Толщина мозгового вещества –в период новорожденности самая наименьшая, а в период старости -наибольшая [50].

Корковое вещество состоит из веретеновидных тесно расположенных клеток, напоминающих набухшие фибробласты, и межклеточного вещества, которого очень мало. Но его тонкая внешняя зона представляет собой полосу коллагеновой стромы, которая содержит относительно мало клеток. Внутренняя зона коркового вещества яичников состоит из фолликулов, являющихся основной структурно-функциональной единицей [9].

Фолликулы подразделяются на примордиальные, первичные, вторичные и третичные(Граафовы), согласно Международной гистологической номенклатуры(1999). Их развитие происходит по схеме: примордиальный → первичный → вторичный → третичный [21]. Начало развития примордиальных фолликуловспиралевидных артерий и примордиальных фолликулов отмечается с периода полового созревания. В репродуктивный период фолликулы расположены в строме коркового вещества, примордиальные – напериферии, а зреющиев более глубоких зонах[25,51].

Примордиальный фолликул состоит из одного слоя плоских фолликулярных клеток ооцита первого порядка. Ооцит — ключевой элемент, основа функционального и структурного единства фолликулярного комплекса [49].

В примордиальных фолликулах гранулезные клетки небольших размеров. В дальнейшем увеличивается число и размеры гранулезы. Они становятся кубическими, цилиндрическими, формируют несколько слоев [27,28].

На начальных стадиях фолликулогенеза изменение размеров ооцита пропорциональноросту примордиального фолликула [33]. Первичные фолликулы формированы ооцитом первого порядка, который окружен немногочисленными слоями фолликулярных клеток в виде формы цилиндра или куба. Как только созревает фолликул, его окружают слоями веретенообразные клетки и увеличиваются в объеме, формируясь эпителиоидные. На периферии остаются слои веретенообразных клеток, которые потом сливаются со стромой.

Вторичный фолликул окружен наружней и внутренней текой, полость выстлана гранулезными клетками. В яичнике одновременно развиваются несколько полостных фолликулов, нодоминантным становится только один [12,13,24].
Он заполняется фолликулярной жидкостью по мере роста, оттесняет яйцеклетку к одному из полюсов, и превращается в граафов пузырек. В яйценосном холмике располагается яйцеклетка. С верхней стороны она покрывается лучистым венцом, блестящей и зернистой оболочками. [1,12,26].

Яйцеклетка с фолликулярной жидкостью выбрасывается в результате разрастания Граафова пузырька. На месте фолликула после овуляции и выброса яйцеклетки образуется желтое тело [12].

При оценке этапов развития фолликула по основным морфологическим признакам (форма и количество слоев фолликулярных клеток, наличие лакун) выделяют такие группы, как:

-примордиальные,

-вступившие в рост однослойные фолликулы,

-однослойные фолликулы с примордиальными ,

-двуслойные,

-многослойные,

-лакунарные.

Рост и развитие фолликулов делятся на стадии:

1) образование пула растущих фолликулов;

2) рост до стадии антрального фолликула 4-го класса или базальный рост;

3) формирование и развитие доминантного фолликула.

Зависимость первых двух этапов от гипофизарных гонадотропинов является непрямой и опосредована факторами внутри яичников, а заключительный этап регулируется гипофизом напрямую [12]. Роль факторов клеточной адгезии, которые отвечают за межклеточные взаимодействия, несомненна. Интегрины α 3,6, иβ принимают участие в миграции первичной половой клетки [47]. Важна роль Е-кадерина и Р-кадерина в агрегации клеток при колонизации урогенитальных гребешков,экспрессирующиеся в предшественниках клеток Сертоли [46]. Факторы клеточной адгезии коннексинов играют важную роль в установлении взаимодействия ооцита и окружающих соматических клеток,а также в образовании фолликулов. По литературным данным, грызуны, у которых дефицит по коннексину СХ43, имеют серьезные нарушения в образовании примордиальных фолликулов [56]. Р-селектин играет важную роль на ранних этапах диапедеза лейкоцитов из кровотока во время воспаления [55].

Мозговое вещество яичников образовано рыхлой соединительной тканью. Вокруг нервных стволиков и сосудов нередко определяются маленькие пучки из полигональных или округлых клеток эпителиоидного вида. Эти клетки — рудиментарные остаткигонад, проходящих примитивную двуполую фазу развития. Они напоминают интерстициальные элементы яичек из-за выработки стероидов. Фолликулоциты гранулезной оболочки, текоциты внутренней теки, текоцитоподобные клетки стромы являются стероидпродуцирующими клетками яичников [44].

В литературных источниках нет единого мнения о строении стромы яичника. По данным Боровой Т. Г. (1993), строма яичников представляет собой самый «простой вариант»рыхлой соединительной ткани, практически единственными клеточными элементами, которой в корковом и мозговом веществе являются фибробласты и фиброциты. Помимо этого, в мозговом веществе присутствуют тучные и гладкомышечные клетки, небольшое количество лейкоцитов разной формы. По данным других исследователей строма она представлена двумя видами клеток:

1. веретенообразные, со скудной цитоплазмой, похожие на фибробласты, располагающиеся в плотной сети волокон с различными количествами коллагена;

2. полигональные, с эозинофильной цитоплазмой, свойственными стероидопродуцирующим клеткам ультраструктурными особенностями, богатые липидными включениями [8].

На основании современных представлений, гиалиноз артерий является основным морфологическим признаком стареющей гонады, при этом,вены компенсаторно расширяются. Инволюционный тип строения яичника характеризуется крупнобугристойповерхностьюоргана, склероз стромы, уплотнение белочной оболочки, малочисленность различных типов фолликул, наличие множества белых и фиброзных тел [28].

Овуляция –это динамическое явление, которое характеризуется воспалительным выбросом макрофагами цитокинов [56]. Однако, точной роли воспалительных и иммунологических событий в овуляции остается невыясненной.

Моноциты, макрофаги,ацидофильные гранулоциты, и нейтрофилы, инфильтрируют область, окружающую доминирующий фолликул перед овуляцией. Проникновение лейкоцитов, особенно нейтрофилов, наблюдается в theca слое яичника у человека[52] и крысы непосредственно перед овуляцией. Стромальные макрофаги могут быть вовлечены в регуляцию фолликулярного роста и разрыва, регуляцию эстрального цикла [59].

Только ограниченное число примордиальных фолликулов в яичниках млекопитающих растѐт и дифференцируется, достигая стадии доминантного фолликула и впоследствии овулирует. 99% фолликулов в яичнике подвергаются атрезии на различных стадиях развития. В репродуктивном возрасте атрезия совместно с формированием доминантного фолликула является одним из проявлений физиологии овариальной функции и фолликулогенеза: в ходе роста фолликулы соревнуются за лидерство, и поступательное развитие продолжают только те из них, которые способны обеспечить оптимальное морфофункциональное состояние собственного гистиона. В течение жизни в яичниках человека прогрессивно сокращается содержание половых клеток. Сравнительно небольшой процент этой убыли связан с созреванием и овуляцией ооцитов в репродуктивном периоде, и значительно больший — с атрезией овариальных фолликулов и гибелью половых клеток, происходящими практически в течение всей жизни. Апоптоз – фундаментальный механизм фолликулярной атрезии и постовуляторного регресса у млекопитающих[61].

Со временем наступления половозрелости половые органы самки подвергаются циклическим изменениям, протекающим в организме при участии нейроэндокринных стимулов и находящихся под влиянием факторов внешней и внутренней среды,которые, вероятно, оказывают влияние на формирование женских половых органов[28].
В результате большого количества антропогенных влияний число экологически зависимых патологических нарушений в женской репродуктивной системе растет. Как уже известно, по данным Губаревой Л. И. (2001), в яичниках крыс, которые подверглись воздействию сульфида и кадмия, значительная часть фолликулов на разных фазах созревания погибают. Следовательно,яичник- этоуникальный орган, где происходит постоянное изменение микроциркуляторного русла в течение жизни женщины, перестройка компонентов внеклеточного матрикса, транспорт лейкоцитов и тучных клеток, рости развитие различных функциональных структур: малых, средних, больших и атретических фолликулов, жѐлтых тел. В соответствии с данными литературы можно прийти к выводу, что генеративная и эндокринная функции яичников регулируются сложным комплексом гуморальных показателей[17].

 

1.2 Понятие эстрального цикла и его этапы

 

Под эстральным циклом понимается морфологические изменения, которые происходят циклически в генеративной системе самок, во время которого происходит созревание гамет и их выход в брюшную полость во время овуляции. Регуляцию эстрального цикла обеспечивают гормоны гипоталамо-аденогипофизарной конструкциии женской половой железы. Эстральный цикл делится на четыре фазы: проэструс (предтечка), эструс (течка), метаэструс (послетечка) и диэструс (межтечка). Каждая из фаз характеризуется определенным функциональным и клеточным составом слизистой влагалища, а также его гладко-мышечного слоя [8].

Подготовительной фазой эстрального цикла является проэструс. Происходит усиление продукции гонадотропоцитами аденогипофиза ФСГ под влиянием либеринов гипоталамуса. На данном этапе они переходят в фазу разрастания и начинается выработка эстрогенов. Их основной целью является матка. На данной фазе наблюдаются следующие изменения – слизистая оболочка начинает набухать и утолщаться, количество железистых клеток резко увеличивается, который начинают образовывать жидкий секрет, при этом происходит углубление желез и их разветвивание [36].

Следующая фаза – это фаза эструса. В крови по понятию обратной связи начинается нарастание концентрация эстрогенов,повышение продукции в гипоталамусе статинов. При этом происходит подавление секреции ФСГи лю-либеринов, следовательно,секреция лютеинизирующего гормона (ЛГ) начинается в гонадотропоцитах аденогипофиза . В результате того, что произошел рост концентрации в крови ЛГ, разрываются стенки зрелого фолликула в женской половой железе. Происходит овуляция, следствием чего в крови скапливаются эстрогены. Особенностью эструса является видовая специфика. В это время из наружных половых органов обильно выделяется слизь, когда матка готова принять зародыш [36].

Третьей фазой является метаэструс. Во время данной фазы в том месте, где лопнул зародыш образовывается желтое тело, основной целью которого является выработка прогестерона. Его основной целью является матка, в которой уже наблюдаются выраженные изменения в эндометрии. Эндометрий имеет наибольшую величину в периоде роста желтого тела. При этом железы становятся более глубокими и развлетленными. Гландулоциты начинают выделение густого секрета, который насыщен глюкогеном. В сосудах эндометрия наблюдается переполнения крови. Матка находится на стадии ожидания зародыша [36].

Последней стадией эстрального цикла является диэструс. В случае, если желтое тело не оплодотворилось, оно начинает увядать. Количество прогестерона в крови снижается, и описанные ранее процессы начинают протекать в обратном порядке.

Таким образом, в аденогипофизепродукции ЛГ и ФСГ протекают не в одно и то же время, в связи, с чем в яичнике секреция эстрогена последовательно сменяется продукцией прогестерона и, наоборот, в результате чего в половой системе самок протекают циклические изменения.

 

1.3 Эстральный цикл у крысы

 

Интервал эстрального цикла у мышей и крыс составляет 4-6 дней. Эстральный цикл продолжатся до наступления беременности. Во время беременности, протекающей 19-20 дней деятельность полового аппарата не наблюдается. Укрыс наступает течка на следующий день. После этого наступление эстрального цикла происходит только после завершения периода лактации [19].

Если процесс спаривания не закончился оплодотворением, либо в результате проведенного эксперимента наблюдается ложная беременность, то в матке и влагалище наблюдается изменения, длительность которых составляет 11 суток. значительные изменения влагалищных мазков и эпителия матки на морских свинках показали Stockard и Papanicolaou .

Когда влагалище находится в стадии покоя, оно покрыто слоями плоского эпителия. Вагинальные мазки содержат большой уровень лейкоцитов и малое количество эпителиальных клеток с ядрами.

В период течки клетки верхнего слоя слизистой оболочки влагалища отшелушиваются и происходит потеря ядер. В пробах мазка, которые были сделаны во время течки, находится достаточно большое количество данных чешуйчатых клеток. При этом наблюдается усиление секреции влагалищных желез.

Когда наступает стадия после течки видно, что лейкоцитарная инфильтрация стенки влагалища исчезает на стадии покоя. После чего в мазках можно наблюдать не большое количество клеток эпителиальных и большое число лейкоцитов.

Те изменения, которые были описаны, сопровождаются теми или иными видоизменениями матки.Во время предтечки она растет, железы ее расширяются и начинают выделять жидкость, растягивающая орган. после происходит дегенерация маточного эпителия и лейкоцитарная инфильтрация эндо- и миометрия. После этого лейкоциты исчезают, эпителий восстанавливается и у эндометрия образуется способность формирования децидуальных клеток при последующем спаривании.

 

1.4 Поведенческие эффекты женских половых гормонов.

 

Женский половой гормон — эстроген, вызывающий у женского пола ощущение благополучия и удовлетворения, обуславливающий манеру поведения (стремление нянчить свое потомство и защищать свое гнездышко). Эффект эстрогенов на ЦНС делится геномный и негеномный. При первом влияние действия женских половых гормонов проходит через синаптические контакты и мозговые структуры с помощью специфических рецепторов. Стероиды, которые циркулируют в крови, влияют на функции комплекса, участвующего в организации висцеральных, мотивационных и эмоциональных реакций организма. Геномные эффекты постоянны и контролируют нейронную архитектонику. Негеномные эффекты эстрогенов затрагивают механизмы нейропередачи: изменение концентрации и доступности серотонина и норадреналина, увеличение времени деградации моноаминоксидазы (фермент, метаболизирующийи усиливающий транспорт серотонина), вытеснение триптофана из связанного состояния с альбумином плазмы, что повышает число свободного триптофана, поступающего в мозг, где и превращается в серотонин. Подтверждение важности этих моноаминных нейротрансмиттерных систем в регуляции настроения есть заслуга влияния женских половых гормонов на обмен норадреналина и серотонина в центральной нервной системе. Они оказывают серотонинэргический эффект (повышение активности серотонина). Ряд научных исследований указывают на положительный эффект применения заместительной гормональной терапии на настроение и чувство общего благополучия у женщин в постменопаузе, включая женщин с отсутствием психологических симптомов. Также выявлено, что женские половые гормоны купируют такие симптомы, как тревогу, снижение самооценки и депрессивное настроение. Эстрогены оказывают влияние на ЦНС, и на психическую сферу в частности, посредством нескольких механизмов. Одним из них является прямое психотропное (психостимулирующее и антидепрессивное) действие эстрогенов за счет их серотонинэргического и адренергического эффектов. С другой стороны, вследствие уменьшения вазомоторных симптомов (приливов жара, потливости) улучшается общее самочувствие и психическое состояние пациенток («домино-эффект») [16].

Существуют еще гормон, влияющий на состояние женщины,-прогестерон.Известно, что среди хорошо изученных эндокринных и репродуктивных эффектов, он играет главную роль в регуляции пластических процессов в головном и спинном мозге, периферической нервной системе.Также установлено, что он синтезируется в одинаковых концентрациях у мужского и женского пола в глиальных клетках и нейронах центральной и периферической нервной системы. Его метаболиты связываются с теми же рецепторами, которые опосредуют эффекты противотревожных средств (бензодиазепиновых транквивлизаторов) – ГАМК-А/бензодиазепиновым рецепторным комплексом, и оказывают психотропное действие на организм женщины, что нашло свое место в лечении некоторых форм депрессии, агрессии, мигрени. Активация ГАМК-рецепторов ведет также к улучшению питания нервной ткани. Когда в конце месячного цикла резко снижается секреция прогестерона, ослабляется трофическая функция ЦНС, что проявляется в повышенной утомляемости, раздражительности, расстройствами настроения, среди которых преобладают чувство беспричинной тревоги. С резким падением продукции прогестерона по окончанию беременности связано и повышение частоты депрессивных состояний в послеродовом периоде. Производные прогестерона в гормональных контрацептивах оказывают гипнотический эффект, который используется для лечения предменструального синдрома и психологического стресса [32].

Специфической общепризнанной поведенческой реакцией на стресс является груминг .По данному параметру можно оценить нейрогуморальные изменения в организме. Анализируя характер влияния женских половых гормонов различного происхождения на груминговую активность крыс с исходно разным уровнем активности, выявлено, что естественный женский стероид эстрон стимулирует груминг у низкоактивных крыс и подавляет у средне- и высокоактивных животных. Синэстрол, напротив, не повлиял на груминговое поведение стрессированных крыс. Данный факт указывает на анксиогенное влияние эстрона на низкоактивных в контроле крыс и анксиолитическое – на средне- и высокоактивных стрессированных самцов белых крыс[37].

Учитывая полученные данные, было сделано предположение, что изменения в эстральном цикле и половом поведении обусловлены с дисбалансом эстрогенов и гестогенов в крови связанным с дефицитом магния. В этой связи сочли целесообразным изучить и процессы зачатия у этих самок [29].

 

1.5 Поведенческие особенности крыс линии WAG/Rij

 

В настоящее время в практике поведения клинических исследований используются животные различных линий. Крысы нужны для установления токсичности лекарственных веществ и ядов, широко используются при изучении вопросов питания, проведения биологической стандартизации гормональных препаратов для постановки научных исследований по витаминологии, физиологии, фармакологии, эндокринологии, биохимии и для изучения процессов поведения и других вопросов психологии. Но следует знать поведенческие реакции крыс разных линий.

WAG/Rij – инбредная линия крыс, выведенная из крыс Wistar Albino Glaxo в Великобритании (Wistar Albino Glaxo Laboratory, UK) в 1924г. Позднее эта линия крыс была ввезена в Нидерланды (REPGO Institute of TNO at Rijswijk, The Netherlands). WAG/Rij означает Wistar Albino Glaxo/Rijswijk (Саркисова К.Ю., 2005). Крысы линии WAG/Rij – результат скрещиваний более 130 поколений (Depaulis A., van Luijtelaar G., 2006).

Известно, что один из патогенетических механизмов эпилептической активности у крыс линии WAG/Rij является гипофункция дофаминергической системы мозга [50].

Несмотря на это, механизмы формирующегося снижения активности этой системы нераскрыты. Определено, что дефицит дофаминергической системы у крыс линии WAG/Rij может быть предопределен динамикой функционирования дофаминовых рецепторов [50,53].

Рецепторы D2- самый распространённый тип дофаминовых рецепторов. Они расположены в большем количестве в лимбической системе, в коре головного мозга, в среднем мозге. Стратегия приспособительного поведения зависит от уровня и функционирования данных рецепторов, которая проявляется в двух формах — активная и пассивная [40].
Таким образом, исследование тревожно-депрессивных состояний в зависимости от уровня половых стероидов при изучении эпилепсии и других патологий нервной системы является актуальным и имеет большое практическое значение. Однако эта область исследований мало изученная и требует детальное выяснение взаимосвязи поведения, эмоциональной реактивности и тревожности с уровнем стероидных гормонов в различных отделах мозга для понимания их нейроактивных и нейроэндокринных функций.

 

Глава 2. Материал и методы исследования

 

2.1 Объекты исследования

 

Эксперименты проводились на крысах линии Wistar (n=20) и WАG/Rij (n=20), которые содержались в условиях вивария кафедры физиологии человека и зоологии Башкирского государственного университета, характеризующихся постоянством комнатной температуры (20-22 °C) и уровнем влажности. Животные находились в стандартных пластмассовых клетках по 3-4 особи. Условия содержания для всех крыс были одинаковыми. Клетки, кормушки, поилки и весь необходимый инвентарь систематически обрабатывались с использованием специальных дезинфицирующих средств. В качестве подстилки использовали опилки и мелкую стружку, которые менялись по мере загрязнения, но не реже 1 раза в неделю.Питались в основном зерновой смесью, свежими овощами и творогом.При работе с крысами полностью соблюдались международные принципы Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным (2000 год).

 

2.2 Методы исследования

 

2.2.1 Определение стадий эстрального цикла самок крыс методом влагалищных мазков

 

Мазки из влагалища крыс можно брали двумя способами: с помощью пипетки или ватной палочки. Заранее следует заготовить достаточное количество палочек, так как каждую можно использовать только один раз. На рабочем столе должны находиться емкость с водой, нужное количество обезжиренных предметных стекол и восковой карандаш (маркер использовать не рекомендуется, так как при фиксации препарата надпись растворится). Обезжиривание обычно проводят длительным выдерживанием предметных стекол в растворе этанола с диметиловым эфиром в пропорции 1:1.

Перед взятием мазка ватная палочка погружается в чашку с водой, и капля воды переносится на предметное стекло. Прикасаться пальцами к тампону нежелательно, так как клетки эпидермиса кожи пальцев, попав мазок, могут нарушить микроскопическую картину. После этого намоченный конец ватной палочки осторожно вводят во влагалище и слегка там поворачивают. Вынув его из влагалища, размазывают захваченную ватой пробу в капле воды, нанесенной на предметное стекло. На стекле подписывают дату взятия мазка и номер крысы.
При систематическом взятии мазков у одних и тех же животных, предпочитают брать пробы глазной пипеткой, во избежание механического повреждения влагалища. Для этого набирается несколько капель воды в пипетку и, неглубоко вводя кончик во влагалище, 1-2 раза выжимают воду из пипетки и насасывают ее обратно. Взятая проба переносится на обезжиренное предметное стекло.

В условиях длительного эксперимента забор влагалищных мазков необходимо проводить в фиксированное время суток [30].

Неокрашенные пробы лучше рассматривать под микроскопом немедленно, так как по мере подсыхания изучение мазка становится более затруднительным. Считается, что более точно мазок распознается в фиксированном и окрашенном препарате [22].

С целью определения ритмичности функционирования яичников, ежедневно анализировали влагалищные мазки. По следующей методике проводили приготовление мазков и анализировали их. Влагалищные смывы брали тонкой глазной пипеткой, помещали на предметное стекло и рассматривали под микроскопом при увеличении в 300 раз в слегка затемненном поле [7]. Эстральный цикл крысы состоит из 4-х фаз: проэструс (предтечка), эструс (течка), метаэструс (послетечка) и диэструс (межтечка, или стадия покоя). Каждой стадии эстрального цикла соответствует определенный клеточный состав влагалищного мазка (табл.1).

После определения фазы полового цикла каждого животного результаты были подвергнуты обработке и анализу.

 

2.2.2 Тест «Открытое поле»

 

Самые разные поведенческие тесты используются для изучения количественных и качественных индексов поведения[22]. Одним из самых распространенных тестов, который используется в основном в составе комплекса тестов, является тест «открытое поле». Круглое открытое поле представляет собой арену 1,5 м в диаметре с высотой стенок 0,8 м, дно которой было расчерчено на сектора. В открытом поле выделяли 3 зоны, по которым далее производили оценку всех количественных показателей: центральная зона, зона середины (6 сегментов), периферическая зона (12 сегментов), (рис. 1).

 

 

Таблица 1. Клеточный состав влагалищного мазка и средняя продолжительность стадий эстрального цикла.

 

Освещение производилось 2 лампами, мощностью по 60 Вт, которые располагались на высоте 1,5 м от дна камеры над центральными сегментами поля. Все процедуры связанные с тестированием в открытом поле проводились с 14.00 до 18.00.

Крыс помещали в центр открытого поля хвостом к экспериментатору и оценивали двигательную и исследовательскую активность животного. Двигательную активность определяли путем подсчета числа пересеченных животным сегментов. Сегмент считался пересеченным, если крыса переступала через линию передними и задними лапами. Общая двигательная активность вычислялась путем суммирования числа пересеченных квадратов в центре, в середине поля и по его периферии. Неподвижностью (сек.) являлся период замирания животного или пассивного бодрствования. Она характеризовалась полным отсутствием локомоции.При обработке эксперимента выделяли неподвижность до первого двигательного акта в поле – латентный период и неподвижность, зафиксированную в течение сеанса тестирования.

Исследовательскую деятельность определяли путем подсчета совершенных вертикальных стоек в различных зонах поля. За стойку принимали положение животного, когда оно отрывало передние лапы от пола, и оставалось лишь на задних лапах. При этом животное вытягивало шею, часто поворачивая голову, и принюхивалось. Общее количество совершенных стоек подсчитывалось при суммировании стоек, совершенных в центре, в середине и на периферии поля.

За эпизод груминга принимали все периоды времени, когда животное проявляло соответствующее поведение по уходу за собственным телом (умывание, вылизывание, вычесывание). Время, посвященное процессу чистки, фиксировалось по зонам, и затем вычислялся общий показатель длительности груминга. Общее число эпизодов груминга характеризовали его интенсивность. Под общим числом мы понимали количество совершенных актов чистки в различных зонах поля. Вегетативные показатели, определяющие эмоциональный статус животного, представляли из себя акты уринации и дефекации. Количество дефекаций и уринаций высчитывали по окончанию тестирования каждого животного. Данные за пятнадцать минут суммировали и заносили в таблицу,после вычисляли среднее значение за 5 дней тестирования. Стандартный режим регистрации соблюдался нами в течение всех 5 дней тестирования. Эксперимент проводился в одно и тоже время дня, в затемненной комнате с освещением центральной площадки поля, без постороннего шума и других раздражителей. После тестирования каждого животного поле тщательно обрабатывалось спиртовым раствором и промывалось водой.

 

2.2.3 Тест «Приподнятый крестообразный лабиринт»

 

«Приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ) представляет собой площадку, имеющую 2 закрытых (со стенками) и 2 открытых (без стенок) рукава, шириной 10 см и длиной 45 см каждый. Лабиринт располагался на высоте 80 см от пола. В центре расположенных крест-накрест рукавов лабиринта находилась открытая площадка ,размером 10*10 см [12].

 

 

Животное помещали на данную площадку и в течение 5 минут регистрировали следующие параметры: число заходов на светлое и темное поле, время нахождения в каждом поле, количество совершенных стоек, неподвижность, частоту уринаций и дефекаций, количество свешивания в светлом рукаве , длительность груминга (сек.),количество эпизодов груминга.

Стандартный режим тестирования сохранялся нами для всех животных. Эксперимент проводился в одно и тоже время дня, без постороннего шума и других раздражителей. После тестирования каждого животного установка тщательно обрабатывалась спиртовым раствором и промывалась водой.

 

2.2.4 Тест «Вынужденное плавание»

 

 

Для оценки уровня депрессивности мы проводили тест «вынужденное плавание» по Порсолту (Porsolt R.D. et al., 1977). Опыты проводились с 13.00. до 17.00. Животных помещали в цилиндрический сосуд (высота 70 см, внутренний диаметр 38 см), заполненный водой на высоту 33 см.: в данных условиях крыса не может ни выбраться, ни найти опору в нем. Температуру воды поддерживали на уровне 25±2ºC. Поведение регистрировали в течение 5 минут. Отмечали основные тестируемые параметры: 1) длительность активного плавания,(сек) (энергичные гребковые движения всеми конечностями); 2) суммарное время иммобилизации,(сек); 3) количество актов груминга; 4) количество ныряний; 5) количество отряхиваний; 6) количество фекальных болюсов. Кроме того, вычисляли индекс депрессивности (ИД), определяемый отношением числа самых коротких периодов иммобилизации длительностью до 6 сек к общему числу периодов активного плавания [7].

---

Страницы: 1 2