2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы и методы исследования
Работа выполнялась на кафедре «Ветеринарно-санитарная экспертиза и биологическая безопасность» Института ветеринарно-санитарной экспертизы, биологической и пищевой безопасности» ФГБОУ ВО «МГУПП», во ВНИИИВСГЭ и фермерском хозяйстве в период 2017 года.
Объектом исследования служили козы в возрасте 7-10 месяцев из фермерского хозяйства, в котором содержалось стадо коз местной аборигенной породы. Количество голов в стаде в течение сезона (года) меняется от 30 до 70-100 в зависимости от количества приплода.
При обследовании стада обнаружены 8 коз, у которых на теле отмечали поражения кожи.
Для диагностики трихофитии тупым скальпелем делали соскоб с периферической части пораженного участка кожи на границе со здоровой кожей вместе с корочками и чешуйками и пораженными волосами. Исследуемый материал помещали в чашки Петри, измельчали ножницами и расщепляли с помощью скальпеля. Затем кусочки волос, чешуек, корочек переносили на предметное стекло, наносили каплю 20 %-ного раствора NaOH или КОН и слегка подогревали над пламенем горелки. После этого добавляли каплю 50 %-ного водного раствора глицерина. На приготовленный таким образом препарат накладывали покровное стекло и просматривали сначала под малым увеличением сухого объектива (Х8), а потом — под большим (Х40) или с помощью иммерсионной системы. Обнаружение мицелия гриба и различных спор в патологическом материале является достаточным основанием для постановки диагноза на дерматомикозы.
Непосредственно в хозяйстве с помощью микроскопа можно определить принадлежность возбудителя к роду Trichophyton или Microsporum, т.е. дифференцировать дерматомикоз. Для этого волосы, чешуйки, корочки помещают на предметное стекло или чашку Петри, заливают 10-15% раствором гидроокиси натрия и выдерживают в течение 20-30 минут в термостате (или слегка подогревают над пламенем спиртовки). После этого препараты помещают на предметное стекло в каплю 50% водного раствора глицерина, накрывают предметным стеклом и просматривают сначала на малом, а затем на среднем увеличении микроскопа. Наблюдают распавшиеся на споры гифы мицелия, располагающиеся в виде цепочек. Споры гриба трихофитона круглой или овальной формы, величиной 3-8 мкм.
Для дифференциации грибов родов Trichopthyton и Misrosporum учитывали характер расположения спор в пораженном волосе (цепочками или мозаичное).
Вид гриба определяли путем посева патологического материала на питательные среды Сабуро путем анализа величины и формы колоний, характеру роста и другим признакам.
Диагноз ставили на основании микроскопических исследований, лабораторных данных и результатов обследования животных люминесцентным методом с использованием ртутно-кварцевых ламп, снабженных стеклом Вуда.
Для лечения трихофитии у животных применяли комплексный препарат для борьбы с эктопаразитами и микозами животных, разработанный ВНИИВСГЭ.
Новый фунгицидный препарат содержит в качестве действующего вещества циперметрин (С22Н19С12О3) – (1RS) цис, транс-3-(Дихлорвинил)-2,2-метил-циклопропанкарбоновой-1кислоты (RS)-3-фенкси-цианобензиловый эфир, клотримазол и вспомогательные компоненты.
Расчет величины ЛД50 при пероральном введении суспензий препаратов проводили по Хабриеву Р.У. «Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2005).
Токсикологические исследования нового фунгицидного препарата для теплокровных животных проводили согласно «Научно-методическим аспектам исследования токсических свойств фармакологических лекарственных средств для животных» (Смирнов А.М. , Дорожкин В.И. 2008 г.) на белых мышах массой 18-25 г, и белых беспородных крысах массой 150-200 г.
Острую токсичность препарата определяли на белых мышах весом 19-21 грамм, клинически здоровых и нормально развитых. Препарат вводили с помощью шприца с иглой, имеющей булавовидное утолщение, непосредственно в желудок из такого расчета чтобы объем вводимого в желудок раствора не превышал 1мл. Дозу исчисляли в мг действующего вещества на кг живой массы. Контрольным животным вводили чистое подсолнечное масло в объеме 1 мл. Исследования проводили в трехкратной повторности. В каждой группе было по 10 мышей. Расчет величины ЛД50 при пероральном введении препарата белым мышам проводили методом пробит-анализа по В.Б.Прозоровскому (1962).
Определение фунгицидной активности препарата (in vitro) по отношению грибам рода Trichophyton проводили методом диффузии в агар.
В стерильные чашки Петри разливали по 20 мл. расплавленной среды Чапека. На поверхность застывшей Среды наносили 1 мл. приготовленной грибковой суспензии, затем с помощью стерильного шпателя взвесь равномерно распределяли по поверхности агара. Для приготовления грибковой суспензии в пробирку с культурой гриба, инкубированной в течение 10 суток при температуре 37°С, наливали 10 мл. физиологического раствора и взбалтывали до получения однородной суспензии. В камере Горяева проводили подсчет конидий и других элементов, взвешенных в жидкости.
Фунгицидную активность препарата изучали методом дисков. На поверхность в центр чашки с застывшей средой, с помощью пинцета выкладывали бумажные диски диаметром 10,0 мм. Диски предварительно пропитывали исследуемой концентрацией препарата. Для этого готовили спиртовые разведения препарата в соотношении препарат: спирт -1:1, 1:10, 1:50 и 1:1000 в которых выдерживали диски, после чего их высушивали и использовали в опытах. Чашки Петри выдерживали при комнатной температуре 30-40 минут и помещали в термостат при 37° С на 48-72 часа.
Оценку результатов проводили по диаметру зоны задержки роста грибов вокруг диска, включая диаметр диска. Зоны задержки или отсутствия роста диаметром свыше 2 см считали эффективными.
Изучение чувствительности кожи к составу препарата изучали на 5 кроликах. За сутки до опыта у каждого животного в области спины с двух сторон туловища выстригали участки шерсти (6 х 4) и определяли толщину кожной складки. С левой стороны на выстриженный участок наносили пипеткой препарат в количестве 50 мг, а с правой стороны — такое же количество дистиллированной воды (контроль). Местное действие препарата изучали в течение 10 дней при экспозиции 4 часа в день. После аппликации кожу кроликов обрабатывали теплой водой с мылом.
Оценку реакции кожи проводили по схеме, принятой по Range Fending Test:
- очень слабое 1 балл;
- вполне определенное покраснение -2 балла;
- умеренное, до сильного покраснения -3 балла;
- тяжелая эритема с образованием корочек — 4 балла.
Изучение кумулятивных свойств комплексного препарата проводили по методу Лима (Lim et all,1961) на 20 белых мышах. В опытах использовали клинически здоровых животных, которые предварительно находились на 15-ти дневном карантине. Первоначально вводимая доза составила 0,1 от однократной ЛД50. Через каждые 4 дня доза увеличивалась в 1,5 раза. Оценку кумулятивных свойств препарата проводили с учетом общепринятого представления о том, что коэффициент кумуляции меньше 1, что свидетельствует о наличии кумулятивных свойств, а больше 1 — о развитии повышенной резистентности к изучаемому соединению.
Контрольным животным непосредственно в желудок вводили дистиллированную воду. Дозы рассчитывали таким же образом, как и для животных опытной группы.
Определение кожно-резорбтивного действия фунгицидного препарата на кожу крыс проводили по следующей методике.
За день до опыта у 20 крыс на холке и спине выстригали шерсть. На следующий день на подготовленный участок кожи животных наносили препарат, в количестве 1 мл. Площадь нанесения продукта была строго постоянной. Экспозиция составляла 4 часа ежедневно на протяжении 7 дней. Для обеспечения полного всасывания наносимого вещества крыс помещали в специальные домики, что предотвращало возможность слизывания препарата животными.
Контрольные животные находились в тех же условиях, но их обрабатывали чистой дистиллированной водой.
Проникшие через кожу вещества можно определить в крови, а также при выделении из организма животных с мочей и калом (И.И.Саноцкий,1970).
В связи с этим, после 7-кратных аппликаций препарата нами было проведено полное обследование животных с помощью различных интегральных и специфических показателей.
В качестве интегральных показателей были использованы масса тела, ректальная температура подопытных животных, оценка морфологического состава периферической крови (содержание гемоглобина, лейкоцитов и эритроцитов).
Исследование центральной нервной системы проводили методом оценки двигательной активности животных. Значительное повышение интереса к использованию поведенческих реакций объясняется, прежде всего, их доступностью и высокой чувствительностью (Бурацкая Е.Н., Витер В.Ф., 1980).
Поведение, как биологический параметр, может быть количественно измерено, и на этом свойстве основаны методы регистрации поведенческих реакций, которые с успехом применяются при изучении вегетативной нервной деятельности.
Метод «открытого поля», использованный нами в работе, основан на исследовании двигательного компонента ориентировочной реакции и эмоциональной реактивности подопытных животных. Автор метода- Hall (1934). Д.А.Кулагин (1969) с успехом применил метод «открытого поля» для исследования поведения крыс. Одновременно он применил и метод «норкового рефлекса».
Методика исследований. Установка представляет собой настольный манеж (высота-360 мм, сторона грани — 200 мм). Основание манежа расчерчено на сектора соответственно количеству граней. В основании манежа вырезаны отверстия -«норки» диаметром 20 мм (8 отверстий).
Животных помещали по одному в манеж и за 3 минуты регистрировали: -«вертикальную» двигательную активность, основанную на подсчете количества вставаний крыс на задние лапы; «горизонтальную» двигательную активность, определяемую по количеству пересеченных при движении секторов; «норковый рефлекс», в основу которого положен подсчет количества заглядываний в отверстия — «норки».
Послеубойную оценку туш проводили согласно «Правилам ветеринарного осмотра животных и ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясных продуктов» которые включают в себя следующие методы исследования:
- патологоанатомические и органолептические (определение степени обескровливания туши, цвет лимфатических узлов на разрезе, проба варкой);
- физико-химические (бактериоскопия мазков-отпечатков, определение pH, реакция на пероксидазу, формольная проба).
Степень обескровливания туши определяли по степени пропитывания полоски фильтровальной бумаги (длиной 10 см, шириной 1,5 см), помещенной в свежий разрез на несколько минут. При плохом обескровливании кровью пропитается не только та часть бумаги, которая соприкасается с мясом, но и свободный ее конец.
Определяли цвет лимфатических узлов на разрезе. Лимфоузлы на разрезе в тушах здоровых животных и своевременно разделанных имеют светло-серый или желтоватый цвет. В мясе животных, тяжело больных, убитых в агональном состоянии, или павших, лимфоузлы на разрезе имеют сиренево-розовую окраску. Кроме того, в зависимости от заболеваний в лимфоузлах будут обнаруживаться различные формы воспалительных процессов, кровоизлияния, некрозы, гипертрофии.
Для определения свежести мяса проводили пробу варкой. Для этого 20 гр. измельченного мяса до состояния фарша помещали в коническую колбу на 100 мл., заливали 60 мл. дистиллированной воды, перемешивали, закрывали часовым стеклом, ставили в кипящую водяную баню и нагревали до 80-85ºС, до появления паров. Затем, приоткрывая крышку, определяли запах и состояние бульона. Бульон из мяса тяжело больных, как правило, имеет неприятный, или медикаментозный запах, он мутный с хлопьями. И наоборот, бульон из мяса здоровых животных имеет приятный, специфический мясной запах, и он прозрачный.
Бактериоскопия глубоких слоев мышц, внутренних органов и лимфатических узлов имеет целью предварительного (до получения результатов бактериологического исследования) обнаружения возбудителей инфекционных заболеваний и обсеменения мяса условно-патогенной микрофлорой (кишечная палочка, протей и др.).
Кусочки мышц, внутренних органов или лимфоузлов прижигали шпателем, затем при помощи стерильных пинцета и ножниц из середины вырезали кусочек ткани и делали мазки-отпечатки на предметном стекле. Сушили на воздухе, фламбировали над пламенем горелки и окрашивали по Грамму. Препарат через фильтровальную бумагу окрашивали раствором карболового генцианвиолета, через 2 мин. фильтровальную бумагу снимали, краску сливали и, не промывая препарата, обрабатывали его раствором Люголя – 2 мин., обесцвечивали 95% спиртом – 30 сек., промывали водой, докрашивали фуксином Пфейфера – 1 мин., вновь промывали водой, высушивали и микроскопировали под иммерсией.
Определение бактерий из рода сальмонелл. Сущность метода заключается в определении характерного роста сальмонелл на элективных средах и установлении биохимических и серологических свойств. Навеску продукта массой 25 г от объединенной пробы вносили во флакон, содержащий 100 см3 среды обогащения (Мюллера-Кауфмана, магниевый или селенитовый бульон). Флаконы тщательно встряхивали и помещали в термостат с температурой 37 °С. Через 16-24 ч после тщательного перемешивания с помощью бактериологической петли или пастеровской пипетки проводили посев из среды обогащения в чашки Петри с предварительно подсушенной средой Эндо, Плоскирева, Левина или висмут-сульфит-агар (ВСА) (по выбору).
Чашки с посевами помещали в термостат с температурой 37 °С; посевы просматривали через 16-48 ч, на висмут-сульфит-агаре — через 24-48 ч. С дифференциально-диагностических сред отсевали несколько колоний на трехсахарный агар с мочевиной или среду Криглера с мочевиной. Посевы делали сначала штрихом по скошенной поверхности, затем уколом (2 раза) в глубину столбика, после чего выдерживали в термостате при температуре 37 °С в течение 24 ч. Учитывали способность культуры ферментировать глюкозу с образованием газа, а лактозу и мочевину не разлагать. Трехсахарный агар с мочевиной имеет малиновый цвет. Отсутствие изменения цвета скошенной поверхности указывало на то, что лактоза и сахароза исследуемой культурой не разлагаются. Для дальнейшей идентификации бактерий готовили мазки, которые окрашивали по Грамму, микроскопировали.
Величину рН мяса определяли рН-метром.
Реакция на пероксидазу. Сущность реакции заключается в том, что находящийся в мясе фермент пероксидаза разлагает перекись водорода с образованием атомарного кислорода, который и окисляет бензидин.
Ход реакции: в пробирку наливали 2 мл вытяжки из мя Ход реакции: в пробирку наливали 2 мл вытяжки из мяса (в концентрации 1:4), приливали 5 капель 0,2% спиртового раствора бензидина и добавляли две капли 1% раствора перекиси водорода.
Вытяжка из мяса здоровых животных приобретает сине-зеленый цвет, переходящий через несколько минут в буро-коричневый (положительная реакция). В вытяжке из мяса больного или убитого в агональном состоянии животного сине-зеленый цвет не появляется, и вытяжка приобретает сразу буро-коричневый цвет (отрицательная реакция).
Формольная проба (проба с формалином). При тяжело протекающих заболеваниях еще при жизни животного в мышцах в значительном количестве накапливаются промежуточные и конечные продукты белкового обмена – полипептиды, пептиды, аминокислоты и др.
Суть данной реакции заключается в осаждении этих продуктов формальдегидом. Для постановки пробы необходима водная вытяжка из мяса в соотношении 1:1.
Для приготовления вытяжки (1:1) пробу мяса освобождали от жира и соединительной ткани и взвешивали 10 гр. Затем навеску помещали в ступку, тщательно измельчали изогнутыми ножницами, приливали 10 мл физиологического раствора и добавляли 10 капель 0,1 н. раствора гидроксида натрия. Мясо растирали пестиком. Полученную кашицу переносили с помощью ножниц или стеклянной палочки в колбу и нагревали до кипения для осаждения белков. Колбу охлаждали под струей холодной воды, после чего ее содержимое нейтрализовали добавлением 5 капель 5% раствора щавелевой кислоты и фильтровали через фильтровальную бумагу. Если вытяжка после фильтрования остается мутной, ее фильтруют вторично или центрифугируют. Если нужно получить большее количество вытяжки берут в 2-3 раза больше мяса и соответственно в 2-3 раза больше и других компонентов.
Выпускаемый промышленностью формалин имеет кислую среду, поэтому его предварительно нейтрализуют 0,1 н. раствором гидроксида натрия по индикатору, состоящему из равной смеси 0,2% водных растворов нейтральрота и метиленового голубого до перехода цвета из фиолетового в зеленый.
Ход реакции: в пробирку наливали 2 мл, вытяжки и добавляли 1 мл нейтрализованного формалина. В вытяжке из мяса больного животного выпадают хлопья. Вытяжка из мяса здорового животного остается жидкой и прозрачной или слабо мутнеет.
Проведение дегустационных исследований предусматривает оценку качества мясного бульона по следующим показателям: вкус, аромат, наваристость, цвет, прозрачность.
Для этого вида мяса разработана также шкала оценки качества вареного мяса. Вареное мясо оценивается по следующим показателям: нежность, сочность, вкус и аромат.
Все образцы для данного метода имели одинаковые размеры, температуру, степень измельчения. Для приготовления бульона вес пробы мяса рассчитывался в соотношении к воде 1:4. Все образцы для дегустации готовились в одинаковых условиях.
2.2. Результаты исследований
2.2.1. Изучение острой токсичности препарата
Изучение острой токсичности препарата показало, что ЛД50 препарата составляет 3461,66+212,0 мг/кг. Результаты представлены в табл. 1.
Таблица 1 — Острая токсичность (ЛД50) препарата
| ЛД50 (мг/кг) | Доза препарата, вводимого мышам в желудок, мг/кг | Конт- роль | ||||||
| 1100 | 1500 | 2000 | 2700 | 3500 | 4400 | 5400 | ||
| Живые | 10 | 9 | 8 | 7 | 5 | 4 | 0 | 10 |
| Погибшие | 0 | 1 | 2 | 3 | 5 | 6 | 10 | 0 |
| Z | 0,5 1,5 2,5 4 6,5 8 | |||||||
| D | 400 500 700 800 900 1000 | |||||||
| Z ×d | 200 750 1750 3200 5850 8000 | |||||||
| åZ ×d | 34250 | |||||||
ЛД50 = ЛД100 — å Z ×d/n
ЛД50 = 5400 – (19750:10) = 3425 мг/кг
- во второй серии опытов = 3446 мг/кг
- в третьей серии опытов = 3512 мг/кг
- среднее ЛД50 = 3461,66+212,0 мг/кг
При введении препарата мышам в (максимальных дозах) клиническая картина интоксикации проявлялась наиболее быстро и уже через 120 минут у мышей наблюдалось угнетение, малоподвижность и вялость, развивался паралич задних и передних конечностей. При введении препарата в минимальных дозах (600 и 1100 мг/кг массы тела), гибель мышей не наблюдалась, однако в состоянии угнетения они находились в течение 24 часов.
2.2.2. Изучение фунгицидной активности препарата
Результаты изучения фунгицидной активности препарата показали, что препарат обладает выраженной фунгицидной активностью уже в концентрации 0,001% по ДВ, а 0,01%-ные и выше растворы вызывают полную задержку роста грибов на чашках.
Таблица 2 — Концентрация разведений препарата и зона задержки роста
| Разведения препарата | Зона задержки роста (мм) |
| 1:0 (ДВ 0,1/0,5%) | полная задержка роста |
| 1:10(0,01/0,05) | полная задержка роста |
| 1:50(0,002/0,0051) | полная задержка роста |
| 1:100 (0,001/0,005) | 41,2+0,11 |
Полученные данные послужили основой для разработки режимов использования препарата при микозах.
2.2.3. Изучение кожно-резорбтивного действия препарата
Результаты исследований кожно-резорбтивного действия препарата на кожу крыс показали, что опытные крысы по внешнему виду и поведению не отличались от таковых контрольной группы. Гибели животных ни в одной из групп не наблюдали.
Результаты измерения массы тела животных и ректальная температура крыс представлена в табл. 3.
Таблица 3 — Изменение массы тела и ректальная температура у животных после введения препарата
| Группа | Средняя масса тела, г | Средняя температура тела, °С
| ||||
| до опыта | ч/з 3 дня | ч/з 7 дней | до опыта | ч/з 3 дня | ч/з 7 дней | |
| Контроль | 263 | 265 | 264 | 36,8 | 37,0 | 36,8 |
| Опыт | 261 | 263 | 258 | 37,1 | 37,3 | 37,2 |
Как видно из данных таблицы, изменение массы тела и ректальная температура у животных опытной группы на всем протяжении опыта достоверно не отличались от тех же показателей контрольных животных.
2.2.4. Изучение кумулятивных свойств препарата
При ежедневном введении комплексного препарата животные начали гибнуть только на 14 сутки при воздействии вещества в суммарной дозе 25326 мг/кг. У животных через каждые 4 дня регистрировали массу тела, в зависимости от которого рассчитывали величину вновь вводимой дозы.
Таблица 4 — Изменение массы тела подопытных животных
| Дни введения препарата | Масса тела (г) по дням э к с п е р и м е н т а | Вводимая доза (мл) по дням эксперимента | ||
| опыт | контроль | Опыт | Контроль | |
| 1-4 | 26,5+0,43 | 24,3+0,43 | 0,0261+0,0004 | 0,0261+0,0004 |
| 5-8 | 26,4+0,65 | 26,4+0,86 | 0,0390+0,0009 | 0,039 +0,001 |
| 9-12 | 26,4+0,59 | 27,6+0,97 | 0,058 +0,001 | 0,059 +0,002 |
| 13-16 | 24,8+0,54 | 26,8+0,86 | 0,094 +0,002 | 0,093 +0,003 |
Коэффициент кумуляции нового препарата составил более 4, т.е. препарат относится к группе слабо кумулятивных продуктов согласно классификации Ю.С. Кагана (1964).
По результатам проведенных исследований можно сделать вывод, что комплексный препарат не обладает свойством кумулироваться в организме животных, что является важным санитарно-гигиеническим критерием оценки безвредности данного соединения.
2.2.5. Влияние препарата на гематологические показатели
Результаты исследований влияния препарата на гематологические показатели крыс после 7-дневного нанесения на кожу приведены в таблице 5.
Таблица 5- Функциональное состояние кроветворной системы после 7-дневного нанесения фунгицидного препарата на кожу белых крыс (М±m)
| Лейкоциты, | Эритроциты, | Гемоглобин, | |||
| Опыт | контроль | Опыт | контроль | опыт | контроль |
| 11,4±1,03 | 12,4±1,01 | 5,3±0,54 | 4,8±0,43 | 15,8±0,47 | 14,7±0,4 |
В результате исследований не выявили значительных изменений гематологических показателей при длительном использовании исследуемого препарата.
2.2.6. Результаты исследований влияния препарата на центральную нервную систему
Результаты исследований центральной нервной системы методом оценки двигательной активности животных приведены в табл. 6.
Таблица 6 — Оценка двигательной активности у крыс после 7-дневной аппликаций препарата на кожу (М±m)
| Горизонтальная активность | Вертикальная активность | «Норки» | Интегральная оценка | ||||
| Опыт | контроль | опыт | контроль | Опыт | контроль | опыт | контроль |
| 24,69±6,4
| 19,7±3,7
| 7,2±1,7
| 4,18±0,75
| 10,15±2,54
| 6,91±2,10
| 42,8±4,62
| 30,1±6,6
|
| 0, | 73 | 1, | 57 | 0, | 98, | 1, | 46 |
Примечание: P>0,05
Из данных таблицы видно, что у животных опытной группы установлено некоторое повышение двигательной активности по сравнению с контрольными
Результаты показали, что эти различия статистически недостоверны (P>0,05), следовательно, не являются гигиенически значимыми.
2.2.7. Выявление больных трихофитией животных
При осмотре стада коз в фермерском хозяйстве, нами было выявлено 8 животных, у которых на теле отмечали поражения кожи.
У 4 коз наблюдали очаги поражения овальной или округлой формы размером 1,0-1,5 и 2,0-3,0 см, покрытые шелушащимися корками, которые имели серо-розовый и серо-зеленый цвет. Корочки с волосами крепко удерживались на утолщенной, мокнущей, кровоточащей, местами гнойной поверхности кожи. При надавливании на кожу в месте поражения просачивается сероватый липкий экссудат. Такие поражения локализировались в области головы, конечностей и на боках животных. Такие явления, по мнению исследователей, могут являться признаками начальной стадией средней или тяжелой формы болезни.
У 4 коз выявлена более легкая форма течения заболевания. Пораженные участки кожи имели овальную форму размером 1,5-2,5 и 3,0-3,5 см. Поверхность пятен была покрыта асбестоподобными корками серовато-белого, местами — серовато-зеленого цвета. Пораженные участки локализировались в области головы, губ, верхней части ушных раковин, в области шеи, груди и на передних конечностях.
Со слов хозяйки, в начале заболевания корки были еле видны, а к 30-45 дню корочки приподнимались, центр у них был куполообразный. Такие пораженные участки были почти не заметны с шерстным покровом.
В патологическом материале (корневые части волос, чешуйки), взятом с трихофитийных очагов, обнаруживали мицелии и округлые споры, расположенные цепочками снаружи волоса или внутри волоса; может встречаться смешанная форма поражения.
У основания волоса снаружи и внутри споры образуют характерный чехол. В посевах патологического материала на агаре Сабуро начало роста — в виде мелких колоний, покрытых пушистыми ворсинками, которые заметны через 7-10 суток. В последующих пересевах рост несколько ускоряется, колонии серо-белого цвета, главным образом складчатые с несколько приподнятым центром. В последующих пересевах рост несколько ускоряется, колонии серо-белого цвета, главным образом складчатые с несколько приподнятым центром.
Вид гриба был определен путем посева патологического материала на питательные среды Сабуро путем анализа величины и формы колоний, характеру роста и другим признакам.
При микроскопии наблюдали распавшиеся на споры гифы мицелия, располагающиеся в виде цепочек. Споры гриба трихофитона круглой или овальной формы, величиной 3-8 мкм.
2.2.8. Изучение лечебного действия препарата на спонтанно больных трихофитией животных
Положительные результаты лабораторных опытов, а также необходимые данные по токсичности препарата послужили основанием для проведения производственных опытов.
Температура воздуха в помещении в момент обработки животных была в пределах 18-20 °С.
До проведения обработки коз перед кормлением у них брали кровь для биохимического исследования. Количество гемоглобина, эритроцитов и лейкоцитов в крови учитывали на протяжении всего процесса выздоровления (на 3, 7 и 10 сутки) после обработки препаратом.
Обработку животных проводили при помощи ватно-марлевых тампонов смоченных в препарате. Шерсть вокруг пораженных участков выстригали и сжигали. На пораженные участки кожи препарат наносили без предварительного удаления корок. Обработку проводили ежедневно в течение 7 дней.
Через 72 часа после обработки был проведен соскоб с пораженных участков кожи и сделан посев материала на соответствующие питательные среды.
Наблюдение за подопытными животными вели в течение месяца, за это время соскобы брали через 3, 7, 14 и 28 дней после начала опыта.
Выздоровевшими животными считали тех, у которых при лабораторном исследовании соскобов не обнаруживали рост культуры гриба.
Препарат не оказывал отрицательного влияния на качество кожно-волосяного покрова коз, не вызывал дерматита, шелушения эпидермиса кожи, выпадения волос.
Хозяйке коз, которые подвергались обработке препаратом, рекомендовали провести санитарную обработку помещения и места, отведенного для них.
После обработки больных животных фунгицидным препаратом отсутствие роста гриба на питательных средах наблюдалась уже через 72 часа.
Применение фунгицидного препарата обеспечивает полное излечение животных после применения его в течение 7 дней. Его использование не вызывает нарушения физиологического состояния животных, явлений токсикоза и других изменений кожного и волосяного покрова животных, не оказывает раздражающего действия на слизистые оболочки и органы дыхания, как животных, так и ветеринарного персонала.
Исследуемый препарат хорошо смачивает корочки, снижает раздражение и зуд.
Состояние животных заметно улучшилось, стабилизировался аппетит, повысилась двигательная активность.
К завершению исследований через 28 дней после первой обработки во взятых соскобах не было обнаружено роста гриба, исследования под воздействием ультрафиолетовых лучей (люминесцентный метод) не выявили больных животных. На 3-4 сутки наступает подсыхание и отторжение корочек, идет активная грануляция пораженных участков эпителия, отсутствует гиперемия и отечность.
Использование фунгицидного препарата не вызывает нарушения физиологического состояния животных, явлений токсикоза, воспаления и других изменений кожного и волосяного покрова мелкого рогатого скота, не оказывает раздражающего действия на слизистые оболочки и органы дыхания, как животных, так и ветеринарного персонала.
Известно, что кровь является основным индикатором, отражающим процессы метаболизма в организме животных. Многие авторы отмечают, что состав крови во многом зависит как от состояния организма в целом, так и отдельных органов и тканей. При развитии патологических процессов может изменяться морфологический состав крови. Поэтому мы проводили комплексный анализ крови с целью сравнения основных показателей у подопытных и контрольных животных.
Оценка морфологического состава периферической крови подопытных животных (содержание гемоглобина, эритроцитов и лейкоцитов в 1 мл крови), на примере коз, позволяет четко проследить процесс восстановления жизненных функций организма. Результаты исследований представлены в табл. 7.
Таблица 7 — Показатели крови коз, обработанных фунгицидным препаратом в терапевтической дозе из расчета 2 мл на животное
| Сроки наблюдения | Показатели | ||||
| Эритроциты 1012/л | Гемогло- бин, г/л | Лейкоци- ты, 109/л | СОЭ по Панченкову через 1 час | ||
| Вертикальное положение пипетки | Пипетка под углом 50° | ||||
| 60 минут | 17,4±0,1 | 88,1±0,7 | 11,2±0,1 | 4,2+0,1 | 31+2,0 |
| 24 часа | 17,5+ 0,3 | 89,2±0,6 | 10,9+0,5 | 4,4+0,2 | 30+1,5 |
| 48 часов | 17,4+ 0,4 | 89,8+0,5 | 11,3+0,5 | 3,9+0,2 | 32+1,0 |
| 5 суток | 17,8 + 0,1 | 88,7+0,4 | 10,8+0,4 | 4,1+0,3 | 29+0,6 |
| Контроль (до обработки) | 17,5+ 0,3 | 88,6+0,5 | 11,1+0,4 | 4,2+0,1 | 30+0,5 |
Из данных таблицы видно, что при трихофитии у животных отмечается ярко выраженный лейкоцитоз, свидетельствующий о воспалительном процессе в организме коз. На 5 сутки после обработки животных фунгицидным препаратом показатель уровня лейкоцитов в крови опытных животных практически соответствует физиологической норме для данного вида животных.
2.2.9. Ветеринарно-санитарная оценка продуктов убоя коз после применения препарата
После проведения лечебных мероприятий через 28 дней животные были убиты с целью проверки мяса по показателям как качества, так и безопасности.
Отборы проб и органолептические исследования мяса проводили по ГОСТ 20235-74, 7702.0-74.
Поверхность туш, полученные от убитых животных, имела красный цвет, жир был белый, на разрезе мышц крови не наблюдали. Сосуды под плеврой и брюшиной не просвечивались, межреберные сосуды выглядели в виде светлых тяжей.
Цвет лимфатических узлов на разрезе был светло-серый или желтоватый цвет. Лимфоузлы не были увеличены, воспалительные процессы, кровоизлияния, некрозы, гипертрофии не наблюдались.
Мышцы упругие, на разрезе умеренной влажности. Ямка при надавливании пальцем быстро выравнивалась Посторонних запахов в жировой и мышечной ткани, свойственных несвежему мясу, не отмечали. На поверхности и на глубине разреза мясо имело специфический запах, соответствующий мясу здорового животного.
Влажная поверхность мяса способствует быстрому развитию микроорганизмов на его поверхности. Образующаяся на поверхности корочка подсыхания за счет подсушивания поверхностной соединительно-тканной пленки (поверхностной фасции) делает тушу сухой и препятствует распространению микроорганизмов внутрь.
Наличие липкости и пятна на фильтровальной бумаге свидетельствует о сомнительной свежести мяса, однако в данном случае мышцы на разрезе слегка влажные и имели характерный вид для данного мяса, что также свидетельствует о доброкачественности мяса.
Образующиеся продукты гидролиза (альбумозы и пептоны) при варке испорченного мяса переходят в бульон, делая его вязким и мутным. При оценке мяса с помощью пробы варкой установлено, что бульон был прозрачным, с выраженным ароматом и приятным вкусом, что свидетельствует о созревшем и доброкачественном мясе.
При бактериологическом исследовании мышечной ткани и внутренних органов обеих групп коз не установлено обсеменение тушек аэробной и анаэробной микрофлорой. В отдельных случаях из легких, селезенки и лимфатических узлов коз были выделены единичные грамположительные кокковые микроорганизмы, которые по морфологии, культуральным и биохимическим свойствам соответствовали Staph. albus. Выделение данной культуры подтверждалось характерным ростом в виде круглых, с ровными краями, несколько выпуклых колоний, окрашенных в белый цвет, на мясо-пептонном агаре и в виде мелких, прозрачных колоний – на кровяном агаре, без зоны гемолиза. Идентификацию выделенного микроорганизма проводили с учетом ферментативной способности, гемолитической и дезоксирибонуклеазной активности.
Выделенный микроорганизм не разжижал желатину, не свертывал кровяную сыворотку, не расщеплял маннит, не вызывал коагуляцию плазмы крови кролика и гемолиза эритроцитов барана, а также не обладал дезоксирибонуклеазной активностью.
Таким образом, последний отнесен к непатогенным в связи отсутствием ДНК-азной, плазмокоагулирующей и гемолитической активности.
При бактериологическом исследовании мышечной ткани и органов контрольных коз, из легких также выделена культура Staph. albus, не обладающая ДНК-азной, плазмокоагулирующей и гемолитической активностью.
При микроскопии мазков-отпечатков из поверхностных мышц туш выявляли наличие единичных кокков — до 10 штук в поле зрения. При микроскопии мазков-отпечатков из глубоких слоев мышц обнаруживали в поле зрения микроскопа 10-15 кокковых форм и 2-3 грамотрицательные палочки. Следов распада мышечной ткани не выявляли.
Таким образом, на основании комплексного исследования мясо коз после обработки препаратом признано свежим, доброкачественным.
Дегустационная оценка продуктов убоя коз
Проведение дегустационных исследований предусматривает оценку качества мясного бульона по следующим показателям: вкус, аромат, наваристость, цвет, прозрачность.
При этом показатели бульона и вареного мяса оценивались по 9-балльной системе (метод ВНИИМП), включающей определение уровня качества каждого показателя по интенсивности его в данном продукте, и по ГОСТ 9959-91, прозрачность и аромат бульона определяли согласно ГОСТ 7269-79.
Дегустация, при всей ее субъективности позволяет с большей точностью установить малейшие изменения в продукте, которые иногда не могут быть определены даже самыми чувствительными лабораторными методами. С помощью дегустации могут быть получены предоставления о свежести продукта, его зрелости, степени загрязнения, предшествующих условиях хранения, обработки и т.д. Дегустация самый простой и доступный метод определения качества и свойств продукта, применимый почти во всех условиях.
Дегустационная оценка отдельных показателей качества продукта осуществляется в соответствии с естественной последовательностью органолептического восприятия органами чувств. Вначале оценивают качественные показатели при помощи органов зрения внешний вид, форму, цвет, затем запах, определяемый в полости рта при разжевывании: вкус, консистенция (нежность, жесткость), сочность.
Одним из важнейших свойств, определяющих качество мяса и мясопродуктов, является консистенция, которая очень высоко оценивается потребителем. Консистенция мяса в значительной мере обусловлена состоянием миофибриллярных белков, степенью ассоциации актина и миозина, а также агрегационным взаимодействием мышечных белков и их деструктивными изменениями. На нежность и сочность оказывает влияние величина рН мышечной ткани, определяющая степень гидратации мышечных белков.
Таблица 8 — Сводная таблица результатов дегустации бульона из мяса коз
| Показатели качества | Группа, баллы | |||
| 1 (n=4) | % к контр. | 2 (n=4) | % к контр. | |
| Запах/аромат | 6,55±0,27 | 100 | 6,30±0,25 | 96,5 |
| Вкус | 6,20±0,25 | 100 | 6,67±0,26 | 107,3 |
| Внешний вид(прозрачность и цвет) | 7,25±0,31 | 100 | 7,44±0,26 | 101,5 |
| Наваристость (крепость) | 6,15±0,27 | 100 | 7,40±0,32 | 121,5 |
| Общая оценка | 6,10±0,26 | 100 | 6,55±0,27 | 106,4 |
Р≤0,05
Исходя из данных таблицы 8, можно заключить, что применение фунгицидного препарата не ухудшает органолептические показатели бульона из мяса коз экспериментальной группы, таких как, вкус, наваристость, крепость по сравнению с представителями контрольной группы. Общая оценка бульона из мяса коз опытной группы на 5,4% превышает контрольные образцы.
Таблица 9 — Сводная таблица результатов дегустации вареного мяса коз
| Показатели Качества | Группы | |||
| 1 (n=5)
| % к контр. | 2 (n=5) | % к контр | |
| Запах/аромат | 6,89±0,30 | 100 | 6,89±0,27 | 100 |
| Внешний вид | 7,44±0,38 | 100 | 6,98±0,28 | 93,8 |
| Вкус | 5,89±0,25 | 100 | 6,89±0,29 | 116,9 |
| Нежность/ Жесткость | 5,22±0,29 | 100 | 7,11±0,32 | 136,2 |
| Сочность | 5,44±0,31 | 100 | 6,56±0,26 | 120,6 |
| Общая оценка
| 5,78±0,33 | 100 | 7,00±0,30 | 121,1 |
Анализируя данные таблицы 9, следует отметить, что применение фунгицидного препарата не ухудшает качественные показатели мяса коз экспериментальной группы, таких как, вкус, нежность, сочность. Общая оценка, поставленная дегустаторами пробам от опытных коз, на 21,1% превышает контрольные образцы.
Таким образом, результаты исследований показали, что никаких отклонений от стандартных показателей не выявлено. Органолептические и физико-химические характеристики мяса в пределах нормы. По микробиологическим показателям мясо коз, вылеченных фунгицидным препаратом, не содержит патогенной и условно-патогенной микрофлоры, что соответствует показателям свежего мяса.