Технологические особенности препарата трипсин. Часть 3.

Страницы:   1   2   3

---

4. Методика определения качества готового препарата трипсин

Метод определения протеолитической активности  основан на определении количества п — нитроанилина, освобождаемого трипсином из синтетического субстрата – хлоргидрата N-альфа-бензол-DL-аргинин-п-нитроанилида (БАПНА) в определенных условиях.

Препарат имеет 1 п — нитроанилиновую единицу активности (протеолитическую единицу), если при воздействии его на субстрат в течение 1 мин, освобождается такое количество продуктов гидролиза, которое при 405 нм дает величину экстинкции, соответствующую 1 микромолю п — нитроанилина [15].

Для приготовления 0,1 М трис-HCl буферного раствора с рН 7,8.берем 12,114 г трис-(оксиметил)-аминометана и 5,47 г кальция хлорида (CaCl₂×HO) помещаем в мерную колбу вместимостью 1000 мл растворяем в 900 мл HO.Прибавляем 1 М раствора хлористоводородной кислоты при постоянном перемешивании до pH 7,8 и доводим объем раствора водой до метки (срок годности раствора один месяц).

Приготовление раствора субстрата. 100 мг (точная навеска)  хлоргидрата БАПНА «Sigma» растворяем в 10 мл ДМСО (диметилсулфоксид) при нагревании на водяной бане, при температуре 350,5°С. Срок годности раствора трое суток при хранении в холодильнике.

Приготовление 5М раствора уксусной кислоты. В мерную колбу вместимостью 100 мл прибавляем 30 мл уксусной кислоты ледяной, доводим объем раствора водой до метки и перемешиваем.

Для приготовления  испытуемого раствора берем 50 мг (точная навеска) препарата трипсин кристаллический помещаем в мерную колбу, вместимостью 100 мл, прибавляем 70 мл 0,1 М трис-НСl буферного раствора с pH 7,8, перемешиваем до растворения и доводим объем раствора этим же буферным раствором до метки. Затем 2,5 мл полученного раствора помещают в мерную колбу, вместимостью 50 мл, доводим объем раствора 0,1 М трис-HCl буферным раствором с pH 7,8 до метки и перемешивают. Раствор используют свежеприготовленный.

Методика определения протеолитической активности. В две пробирки (опытные) вместимостью 10 мл помещаем 4,4 мл 0,1 М трис-НCl буферного раствора рН 7,8, а в две другие пробирки (контрольные) — 4,8 мл 0,1 М трис-НСl буферного раствора рН 7,8. Далее в опытные пробирки прибавляем по 0,4 мл испытуемого раствора. Все пробирки помещаем в термостат с температурой 250,5°C на 5 минут (по секундомеру) с интервалом в 30 сек. В каждую пробирку прибавляем по 0,2 мл раствора субстрата с интервалом в 30 секунд и выдерживаем в  термостате при температуре 250,5°C 15 мин. Затем для прекращения гидролиза в каждую пробирку прибавляем по 1 мл 5 М раствора уксусной кислоты с интервалом в 30 секунд. Пробы охлаждают и измеряют оптическую плотность гидролизата на спектрофотометре при длине волны 405 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Раствор сравнения – контрольная проба. Параллельно измеряют оптическую плотность раствора п-нитроанилина, контролем для которого является реакционная смесь, используемая для растворения данного реактива [15].

Протеолитическую активность трипсина в протеолитических единицах на миллиграмм (Х) вычисляют по формуле 1:

X = (A*6*100*50) / (K*0,4*15*a*2,5)= (A*2000)/(K*a), ПЕ/мг (1)

где, А — оптическая плотность испытуемого раствора;

а — навеска препарата в миллиграммах;

К —  коэффициент микромолярной экстинкции п-нитроанилина (определяется экспериментально);

50,100 — объем раствора испытуемого препарата, в мл;

2,5 — объем раствора препарата взятый, взятый для разведения, в мл;

0,4 — объем, испытуемого раствора, взятый для анализа, в мл;

6 — объем гидролизата в одной пробирке, в мл;

15 — время ферментативной реакции в мин.

1 мг препарата должен содержать не менее 1,2 п-нитроанилиновых единиц (протеолитических единиц).

Коэффициент микромолярной экстинкции п-нитроанилина вычисляют по формуле 2:

K = (A*138*100*100*P)/(a*1000) = (A*1381*P)/a = (0,2*1381*1)/50 = 5,5 (2)

где, А – оптическая плотность при 405 нм, раствор сравнения- реакционная среда;

а – навеска п-нитроанилина, мг;

138,1 –молекулярная масса п- нитроанилина;

100*100 – разведение навески п-нитроанилина;

Р – дополнительное разведение навески п-нитроанилина;

1000 – пересчет навески в мкг.

Раствор используется свежеприготовленным.

В результате исследования получены следующие показатели (табл.4.1)

Таблица 4.1. Оптическая плотность трипсина

 

Расчет протеолитической активности следующий:

X = (A*6*100*50)/(K*0,4*15*a*2,5) = (A*2000)/(K*a) = (0,21*2000)/(5,5*50) = 1,527 ПЕ/мг.

X= (A*6*100*50)/(K*0,4*15*a*2,5) = (A*2000)/(K*a) = (0,199*2000)/(5,5*50) = 1,447 ПЕ/мг.

Вывод: так как 1 мг препарата должен содержать не менее 1,2 ПЕ, полученные результаты   измерения активности трипсина — 1,527 ПЕ и 1,447 ПЕ, признаются удовлетворяющими  требованиям ФСП на данный препарат.

 

5. Экологические и экономические аспекты производственного процесса

При получение препарата трипсин, на стадиях выделения  фермента происходит образование значительных количеств отходов, которые существенно варьируются по составу. В соответствии с современным подходом к экологической безопасности предприятия, технология производства ферментов должна включать в себя технологические решения переработки образующихся отходов и стоков.

Получение ферментного препарата происходит последовательно при обработки поджелудочной железы различными типами экстрагентов, такими как солевой раствор, растворы кислот и спирта. Переработка отходов поджелудочной железы может быть осуществлена путем использования шлама биомассы непосредственно на корм скоту, поскольку данный отход обладает сравнительной высокой питательной ценностью и является нетоксичным или поступает на завод технических полуфабрикатов.

В производстве ферментных препаратов используется ряд вредных веществ загрязняющих воздух рабочей зоны производственных помещений и атмосферный воздух населенных мест, обладающими токсичными свойствами (табл. 5.1.). Попадая в организм человека, такие вещества могут вызвать отравления и заболевания.

Степень воздействия различных веществ на организм человека зависит от дисперсности раздражителя, его концентрации, продолжительности взаимодействия и путей проникновения на организм. Основными путями проникновения токсических веществ в организм являются органы дыхания, кожа, пищеварительный тракт (при приеме пищи в цехе, недостаточно тщательное мытье рук перед едой [6].

Таблица 5.1. Перечень вредных веществ, загрязняющих воздух рабочей зоны производственных помещений и атмосферный воздух населенных мест

Примечание : «+» опасно также при поступление через кожу

Экономические показатели (табл.5.2.) ООО «Самсон-Мед» за 2014 год  по РСБУ выросла в 2,71 раза до 129,21 млн. руб. с 47,62 млн. руб. годом ранее. руб. с 522,75 млн. руб. за аналогичный период прошлого года. Cебестоимость продукции за отчетный составила 339,04 млн. руб. Прибыль от продаж повысилась в 2,03 раза до 150,88 млн. руб. с 74,36 млн. руб. за аналогичный период прошлого года. Согласно материалам компании, чистая прибыль за 2013 год выросла до 47,62 млн. руб. 2012 год Чистая прибыль ООО «Самсон-Мед» за 2012 год по РСБУ выросла в 3,19 раза до 30,23 млн. руб. по сравнению с 9,48 млн. руб. годом ранее. Это следует из  отчета компании [22].

Таблица 5.2. Экономические показатели предприятия ООО «Самсон – Мед»

 

 

6. Техника безопасности и охрана труда

На предприятии ООО «Самсон-Мед» уделяется  большое  внимание вопросам охраны труда и мероприятиям, призванным обеспечить безопасность всех работающих на предприятиях. Для обеспечения безопасных условий труда постоянно совершенствуются нормы и правила техники безопасности [6].

Система мероприятий по охране труда:

Работники, впервые поступающие на работу допускаются к самостоятельной работе только после прохождения вводного инструктажа по охране труда, вводного инструктажа по пожарной безопасности, первичного инструктажа по охране труда на рабочем месте.

Работа может сопровождаться наличием следующих опасных и вредных технологических факторов:

— использование в технологических процессах токсичных, раздражающих, взрывопожароопасных веществ;

— работа с электроприборами (приборы освещения, электроинструмент, электрифицированное оборудование и т.д.);

— наличие грузоподъёмных механизмов;

— наличие на территории посторонних лиц;

— неудовлетворительное состояние дорожного покрытия (гололед, грязь, неровности дороги и др.);

Курение допускается только в специально отведенных местах, обозначенных соответствующим знаком безопасности.

В случае получения травмы работником или ухудшения  его самочувствия. На производстве принимаются меры по оказанию первой помощи пострадавшему и при необходимости доставку его в учреждение здравоохранения, принимаются меры к сохранению обстановки, такой, какой она была на момент несчастного случая или аварии, если это не угрожает жизни и здоровью людей и не ведет к развитию аварии.

Лица, не выполняющие требования настоящей инструкции, привлекаются к ответственности в соответствии с действующим законодательством.

Требования охраны труда перед началом работы:

— прибывать на работу следует заблаговременно для исключения спешки.

— осмотреть свое рабочее место и оборудование. Убрать все лишние предметы. Убедиться путем визуального осмотра в наличии и исправности инструментов, приспособлений.

— обо всех нарушениях или замечаниях в работе оборудования сообщать руководителю работ и не приступать к работе до их устранения.

Требования охраны труда во время работы:

— выполнять только работу, обусловленную должностными или профессиональными обязанностями, правильно используя при этом средства индивидуальной и коллективной защиты. При необходимости выполнения других работ работник должен получить целевой инструктаж по охране труда у соответствующего руководителя, ответственного за безопасное производство работ.

— необходимо в течение всего рабочего дня содержать в порядке и чистоте рабочее место, не допуская его захламления.

— запрещается входить в технические и хозяйственные помещения, не относящиеся к выполнению непосредственных должностных или профессиональных обязанностей и не предназначенные для нахождения там посторонних лиц.

Требования охраны труда в аварийных ситуациях:

— немедленно прекратить работу, отключить электрооборудование и доложить руководителю работ, в случаях:

1. Поражения кого-либо из работников электрическим током;
2. Обнаружения механических повреждений и иных дефектов электрообрудования и электропроводки, наблюдения повышенного уровня шума или тепловыделения при работе оборудования;
3. Ощущение запаха гари, появления дыма, огня;
4. Прекращения подачи электрической энергии.

Об аварийной обстановке оповестить об опасности окружающих лиц, доложить непосредственному руководителю о случившемся. Не приступать к работе до полного устранения неисправностей.

При обнаружении запаха газа в помещении:

— предупредить работников, находящихся в помещении, о недопустимости пользования открытым огнем, курения, включения и выключения электрического освещения и электроприборов;

— открыть окна (форточки, фрамуги) и проветрить помещение;

— доложить непосредственному руководителю;

— вызвать работников аварийной газовой службы.

В случае возгорания или пожара немедленно прекратить работу, отключить электроприборы, вызвать пожарную охрану, сообщить руководителю работ и приступить к ликвидации очага пожара имеющимися средствами огнетушения, а при невозможности тушения- покинуть опасную зону.

Требования охраны труда по окончанию работы:

— привести в порядок рабочее место, убрать мусор.

— собрать инструмент, детали, приспособления, привести в надлежащий порядок и убрать в отведенное для этого место.

— отключить и обесточить электрооборудование.

— снять средства индивидуальной защиты и поместить их в специально отведенное для этого место.

— сообщить непосредственному руководителю обо всех недостатках, которые имели место во время работы и о принятых мерах по их устранению.

Меры пожарной безопасности:

 Инструкция по охране труда и технике безопасности устанавливает общие требования пожарной безопасности в помещениях и на территории ООО «Самсон-Мед», являющиеся обязательными для исполнения всеми сотрудниками и посетителями предприятия [12]. Все работники предприятия должны допускаться к работе только после прохождения противопожарного инструктажа. Персональная ответственность за обеспечение пожарной безопасности предприятия возлагается на руководителя организации.

Ответственность за пожарную безопасность в служебных и производственных помещениях, закрепленных за структурными подразделениями, возлагается на руководителей структурных подразделений.

Работники предприятия обязаны:

— соблюдать требования пожарной безопасности;

— знать схему эвакуации и место расположения огнетушителей;

— знать правила пользования огнетушителями;

— держать всегда свободными от любых предметов подходы к средствам пожаротушения (огнетушители, пожарные ящики с рукавами).

— хранить легковоспламеняющиеся вещества в соответствии с правилами пожарной безопасности.

Сотрудник, ответственный за пожарную безопасность в производственном помещении, осуществляет: контроль соблюдения в помещениях правил пожарной безопасности, по окончании рабочего дня осмотр помещения, закрытие окон и форточек, отключение освещения и электрооборудования.

 

Выводы

• Поджелудочная железа крупного рогатого скота содержит сложный набор гидролитических ферментов действующих на различные классы веществ – белки, жиры, нуклеиновые кислоты, углеводы. Некоторые ферменты (нуклеазы и амилазы) секретируются в поджелудочный сок сразу в активном состоянии, а другие ферменты — протеазы, фосфолипаза синтезируются тканью железы в виде неактивных предшественников–зимогенов и превращаются в активные ферменты уже в самом поджелудочном соке.

Известно, что поджелудочная железа КРС содержит целый ряд ферментов различной субстратной спецификации, в частности трипсин КФ (3.4.21.4), химотрипсин (3.1.1.3), карбоксиполипептидазы (КФ 3.4.16.1), рибонуклеазы.

• Трипсин содержится в поджелудочной железе в виде предшественника фермента — зимогена, называемого трипсиногеном. Молекулярная масса трипсиногена 23,023,8 кДа. Трипсины различного происхождения имеют близкий качественный и количественный набор аминокислот и форму кристаллов. Молекулы трипсина и трипсиногена имеют глобулярное строение. Бычий трипсин представляет собой белки с сильно выраженными основными свойствами, ИЭТ около pH 10,5, оптимум каталитической активности наблюдается в интервале рН 7,0-9,0, при температуре около 50°С. Трипсин состоит из 223 аминокислотных остатков, образующих одну полипептидную цепь, содержащую шесть дисульфидных связей. Последовательность аминокислотных остатков фермента полностью расшифрована.
• Важным условием правильной организации сбора ферментного сырья является быстрое извлечение его из туши животного, что влияет на активность фермента. С момента извлечения поджелудочной железы до замораживания время не должно превышать 1,5 часа. Для сохранения биологических свойств ферментное сырье после сбора и очистки консервируют.
• В результате экспериментального анализа определения протеолитической активности готового трипсина, было установлено, что активность фермента в образцах составила 1,527 ПЕ и 1,447 ПЕ в 1 мг, что является удовлетворительными требованиям ФСП на данный препарат (1,2 ПЕ).

 

Заключение

На сегодняшний день компания ООО «Самсон-Мед» российское фармацевтическое предприятие полного производственного цикла: от производства субстанций до выпуска готовых лекарственных форм. Продукция компании завоевала себе прочное место на потребительском рынке  труда и пользуется стабильным спросом.

Особое внимание к ферментным препаратам вызвано тем, что ферменты являются высокоактивными, нетоксичными биокатализаторами белкового происхождения, которые широко распространены в природе, без них невозможны многие биохимические процессы и жизнь в целом.

Поджелудочная железа крупного рогатого скота является ценным  вторичным сырьем животного происхождения, которое используется при производстве ферментного препарата Трипсин

Препарат трипсин, выделенный из поджелудочной железы крупного рогатого скота – фермент, обладающий выраженными протеолитическими и противовоспалительными свойствами, расщепляют некротическую ткань, не оказывая действия на живые клетки благодаря наличию в них специфических антиферментов. Этот фермент выделен в кристаллической форме и отличается высокой степенью чистоты. Препарат вызывает также разжижение гнойного содержимого абсцессов, осложненных ран, обладает муколитическим действием. Всю большую актуальность приобретают способы (технологии) получения ферментов из экологически безопасного и доступного животного сырья, которые могут успешно конкурировать со средствами аналогичного действия, производимыми химическим и микробиологическим синтезом [25].

Существует множество подходов выделения и очистки ферментов: высаливание, осаждение органическими растворителями и т.д.

Однако эти методы многостадийны, трудоемки, при этом малоэффективны и не обеспечивают получения ферментов высокого качества. Наиболее перспективными, с точки зрения получения высококачественных белков, являются методы избирательной сорбции на микропористых носителях – сорбентах, не изменяющих лабильную структуру ферментов. В настоящее время на предприятии ООО «Самсон — Мед» внедрена и успешно применяется эффективная сорбционная технология с использованием ионообменных процессов на стадиях разделения и очистки ферментов. Использование сорбционной технологии не только повысило качество выпускаемых препаратов, но и значительно сократило время технологического процесса, существенно снизило энергозатраты на производство единицы продукции. Для действующего в современных условиях предприятия это немаловажный фактор и очень веский аргумент в пользу проведения дальнейших научно-исследовательских работ прикладного характера [25].

ООО «Самсон – Мед» является производственной базой для разработки опытных образцов и экспериментальных серий новых лекарственных препаратов, разрабатываемых учеными. На базе НПЛ ООО «Самсон – Мед» ведутся разработки современных технологий получения большого ассортимента биологически активных веществ из сырья животного происхождения. Производство органопрепаратов имеет большую перспективу и должно развиваться как в направлении получения новых лекарственных форм и препаратов, так и для целей косметологии.

На парфюмерно-косметическом рынке на данный период практически отсутствуют натуральные композиции на основе биологически активных веществ животного происхождения. Производство подобной продукции – дело ближайшего будущего.

 

Список литературы

1. ГОСТ 11285-93 «Железы поджелудочные крупного рогатого скота и свиней замороженные. Технические условия».
2. ГОСТ 17768- 90 «Средства лекарственные. Упаковка, маркировка, транспортирование и хранение».
3. Веремеенко К.Н. Ферменты протеолиза и их ингибиторы в медицинской практике. Киев.: Здоров’я, 1971.- 216с.
4. Вракин В.Ф., Сидоров М.В. Морфология сельскохозяйственных животных.- М.: Агропромиздат,- 1991. — 528 с.
5. Грачева И.М., Кирова А.Ю. Технология ферментных препаратов.- М.: Элевар,- 2000.- 512 с.
6. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов.- М.: Агропромиздат, — 2000.- 335 с.
7. Грицай Е.В, Рейн Л.М. Технология Субпродуктов эндокринно-ферментного и специального сырья. М.: Легкая и пищевая промышленность, -1982.- 184 с.
8. Деборин Г.А, М. И. Быстрова, В.Ц. Иванова. Изменение хода протеолиза сывороточного альбумина трипсином при образовании комплексов фермента или субстрата с экстрадиолом. Доклады Академии наук СССР. – 1959.-С.685 -124 .
9. Дэвени Т, Гергей Я. Аминокислоты, пептиды и белки. — М.: Мир, -1976.- 386 с.
10. Дудникова Е. А. Разработка гибкой малоотходной технологии переработки поджелудочной железы КРС с получением гидролитических ферментов. М.: ,-2009.- 160 с.
11. Инструкция по применению Трипсина, Химопсина, Химотрипсина. ООО «Самсон-Мед»
12. Инструкция о мерах пожарной безопасности в ООО «Самсон-Мед». Общие требования пожарной безопасности.
13. Канаев П.А, Шенгер А.А, Борисова Е.Ю. Трипсин – итоги экспериментальных и клинических исследований фармакотерепевтической эффективности препарата //Фармакотерапевтический альманах, 2009,-№ 3. С. — 10 .
14. Мосолов В.В. Протеолитические ферменты. — М.: Наука, -1987. — 404с.
15. Методика определения протеолитической активности Трипсина на предприятии ООО «Самсон-Мед».
16. Нортроп Д, Кунитц М, Херриот Р. Кристаллические ферменты перевод с англ. Н. Е.Плотниковой и др. — М.: Иностранная литература, 1950. — 346 с.
17. Рогов И. А., Забашта А. Г., Казюлин Г. П. Общая технология мяса и мясопродуктов. – М.: Колос, 2000.- 367 с.
18. Рогожкин В.В. Биохимия животных. — СПб.: ГИОРД, 2009. – 472 с.
19. Тарова З.Н, Расторгуев С.Л, Сухорукова Н.В. Ферментные препараты. Получение. Применение. — Мичуринск.: Изд-во МичГАУ, 2014.- 110 с.
20. Технологический регламент комплексного производства ферментных препаратов. – Ленинград, 1989.- 230 с.

Интернет-ресурсы:

21. http://www.allvet.ru/knowledge_base/physiology/anatomiya-i-fiziologiya-podzheludochnoy-zhelezy.php
22. (http://praktikum-po-anatomii-zhivotnyh.odn.org.ua/B3434Part36-170.html)
23. http://www.gastroscan.ru/handbook/120/508
24. http://www.k-agent.ru/catalog/7810173847-1027804852921
25. http://www.medicus.ru/pharmacology/specialist/organopreparaty-osoboe-napravlenie-farmindustrii-31434.phtml

---

Страницы:   1   2   3