Пробиотический потенциал штаммов

Страницы:   1   2

---

ОГЛАВЛЕНИЕ

 

• ВВЕДЕНИЕ
• ГЛАВА I. Обзор литературы
• 1.Практическое значение Р. Freudenreichii: применение и разработка
• новых, способов микробиологической защиты пищевых и сельскохозяйственных продуктов
• 1.1.Использование способности ПКБ подавлять портящие микроорганизмы: биопротекторное действие и технологии биоконсервирования
• 1.2. Микробиологическая защита пшеничного хлеба от «картофельной болезни» с помощью Propionibacterium freudenreichii
• ГЛАВА II. Разработка способов применения P. Jreudenreichii для защиты пшеничного хлеба от «картофельной болезни», вызываемой развитием бацилл
• 2.1. Оценка антиоксидантной активности жидких культур штаммовP. freudenreichii RVS-2-ims (I Рг 2) и P. freudenreichii RVS-4-Irf-(II, Рг 4)
• 2.2. Разработка способов применения P. Jreudenreichii для защиты пшеничного хлеба от «картофельной болезни», вызываемой развитием бацилл
• 2.3.Способы введения пропионовокислых бактерий в пшеничное тесто для достижения защитного эффекта
• 2.4. Применение водного экстракта мучной среды (ЭМС) в качестве искусственной среды при разработке заквасок на основе ПКБ
• ЗАКЛЮЧЕНИЕ
• СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

 

СОКРАЩЕНИЯ

 

АОА- антиоксидантная активность

АФК- активные формы кислорода

АНМФ- антимикробный фактор

АСБ — абсолютно сухая биомасса

БПВ- бактериоцин-подобные вещества

ГКС- глюкозо-кукурузная среда

ЖКТ — желудочно-кишечный тракт

КБ — «картофельная болезнь» хлеба

КЖ — культуральная жидкость

Me — медиана, статистическая характеристика

МКБ — молочнокислые бактерии

ПА — протеолитическая активность

ПКБ — пропионовокислые бактерии

ПК — пропионовая кислота

П-Na — пропионат натрия

пСС — полусинтетическая среда для ПКБ

ПРО — пробиотический микроорганизм (пробиотик)

УК — уксусная кислота

ФАОЗ — ферменты антиокислительной защиты

ЭМС — (водный) экстракт мучной среды

ЭМС/Ld — экстракт мучной среды после культивирования Lactobacillus delbrueckii

Pfr — Propionibacterium freudenreichii

 

ВВЕДЕНИЕ

 

Поиск новых пробиотиков — современная и актуальная проблема. Слова «пробиотики» и «антибиотики» противоположны по смыслу. Понятие «пробиотики» (ПРО) подразумевает живые микроорганизмы с их эк- зометаболитами, поступившие в организм естественным путём, например, перорально, и благоприятно воздействующие на физиологическое состояние макроорганизма животного и человека (см. определение ВОЗ, 2002).

Одним из проявлений их действия является нормализация (регуляция) микробиоты желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) животного и человека. Возникновению и развитию концепции этого нового направления «на стыке» смежных наук физиологии и экологии животных (человека), общей микробиологии, клинической микробиологии, науке о питании человека и других дисциплин, мы обязаны прежде всего русскому ученому, лауреату Нобелевской премии, Илье Ильичу Мечникову. В 1908 году он опубликовал работу по применению болгарской палочки (L. delbrueckii subsp. bulgaricus) в кисломолочных продуктах, что привело к массовому излечиванию желудочно-кишечных заболеваний на Балканах. Понятие «пробиотики» впервые упоминается Лиллеем и Стилвелом (Lilley, Stillwell) в 1965 году, однако исследования стали широко проводится только с 2000 года.

Важные вопросы, которые сейчас являются открытыми, состоят в следующем обязательно ли ПРО должны выживать в ЖКТ (болгарская палочка нежизнеспособна), прикрепляться к эпителию кишечника, колонизировать его (размножаться), вносят ли они вклад в здоровье человека (животного) в целом и какой конкретно.

Среди пробиотических эффектов пробиотиков упоминаются: подавление нежелательной микробиоты и стимуляция истинных (индигенных, автохтонных, хозяйских) пробиотиков или эубиотиков в ЖКТ, иммуно- тропное действие (иммуномодуляция, иммуностимуляция), снижение воспалительных и аллергических реакций, противораковое действие и в целом оздоровление организма животного и человека. [Rolfe, 2000; Шендеров, 2001; Tannock, 2004; Jan, 2004; Nomoto, 2005; Суворов, 2007; Adams, Huang, 2008]. Эти эффекты ПРО-микроорганизмов определяются устойчивостью к агрессивным факторам ЖКТ, способностью функционировать в ЖЕСТ в транзиторном состоянии (если они не являются эубиотиками), а главное, пробиотическими свойствами, обусловленными их специфической физиологией и метаболизмом.

Поиск новых ПРО и правильное их использование, например, в функциональном (клиническом) питании, нацелено на уменьшение применения химических медицинских препаратов, в том числе антибиотиков.

В пищевых технологиях микроорганизмы широко используются. Выбор микроорганизмов для тех или иных микробиологических (пищевых) производств заведомо оправдан, если они уже признаны ПРО, хотя не все «пищевые» микроорганизмы могут и должны, относится к ПРО. Важно, чтобы они были безопасными для человека и осуществляли целевой процесс. Вместе с тем, защита пищевых и сельскохозяйственных продуктов от портящих микроорганизмов и в настоящее время, не исключает применения химических препаратов-ксенобиотиков. Среди них — бензоаты, сорбаты, антибиотики и значительно более вредные химические агенты, например, серный ангидрид.

В настоящей работе мы разрабатывали микробиологическую технологию производства пшеничного хлеба, защищенного от поражения гнилостными бактериями, его «картофельной болезни». Микробными агентами служили классические пропионовокислые бактерии.

Изоляты бактерий-были получены раньше в нашей лаборатории из сыра и по физиологии и морфологии были, отнесенные к Р. Propionibacterium. Они имеют фенотипические разницы, но в результате филогенического анализа были признаны нами как принадлежащие к одному виду: Propionibacterium freudenreichii.

Эта бактерия с 2007 г. имеет статус QPS (Qualified presumtion of Safety) Европейского комитета по безопасности микроорганизмов (EFSA), который действует с 2002 года, и внесена в Список GRAS: Generally Recognized As Safe, USA [Lan et al., 2007]. Подвид этой бактерии (Р. freudenreichii ssp. shermanii) на коловиквиумах GRAS обсуждался дважды: в 2003 и 2008. В настоящее время P. freudenreichii рассматривают в качестве кандидата в пробиотики.

Выявлению и начальному изучению пробиотических свойств семи исследуемых штаммов P. freudereichii, а также разработке эффективного способа приготовления пшеничного хлеба, устойчивого к заболеванию «картофельной болезнью», посвящена настоящая работа.

Целью настоящей работы явилось обнаружение действия исследуемых штаммов классических пропионовокислых бактерий (Р. Propionibacterium) в качестве пробиотиков, начальное изучение их пробиотически значимых свойств и разработка новых способов защиты пшеничного хлеба от гнилостного поражения.

В задачи работы входило:

1. Оценить пробиотически значимые свойства исследуемых штаммов пропионовокислых бактерий их иммунотропую, антимикробную, антиокси- дантную активности, а также способность к образованю некоторых специфических экзометаболитов;
2. Разработать основы накопительной заквасочной технологии производства пшеничного хлеба, устойчивого к бактериальной деструкции («кар- тофльной болезни»)

 

ГЛАВА I. Обзор литературы.

 

Биология Propionibacterium freudenreichii в связи с решаемой проблемой.

Пропионовокислые бактерии (ПКБ) образуют компактный филогенетический кластер в домене (империи или надцарстве) Bacteria. Они принадлежат к царству или филетической линии «Грамположительные бактерии», ветви с высоким содержанием ГЦ-пар в хромосомной ДНК. ПКБ объединены в род Propionibacterium, который входит в состав семейства Propionibacteriaceae.

Philum В XIY Actinobacteria Class I Actinobacteria Subclass I Actinobacteridae Order I Actinomycetales Suborder XII Propionibacterineae Family 1 Propionibacteriaceae Genus I Propionibacterium

Бактерии рода Propionibacterium по местообитанию и специальным фенотипическим и генотипическим характеристикам подпадают под одну из двух категорий [Cummins, Johnson, 1992; Glatz 1992]: классические или «молочные» и «кожные». В настоящее время идентифицированы (признаны) следующие виды пропионовокислых бактерий (ПКБ):

Классические (молочные) ПКБ

Р. freudenreichii (ssp. freudenreichii и ssp. shermanii)

Р. acidipropionici

P.jencenii

P, thoenii

Кожные ПКБ

Р. acnes

1. avid um
2. granulosum
3. propionicus (Arachnid propionica). . P. limphophilum

ПКБ, имеющие особые местообитания

1. innocuum = Propioniferax innocula (1991) — обитает на коже людей, но имеет фенотип классических ПКБ;
2. P. cyclohexanicum (1997) –выделена из сбраживаемого апельсинового сока, физиологически близка P. freudenreichii;
3. microaerophilum (2001) — выделена из промывных вод оливок.

Taxonomic Outline of the Procaryotes Bergeys Manual of Systhematic Bacteriology, Second Edition. Release 3.0 July 2002 http://dx.doi.org/10.1007/bergeysoutline2Q0210

Основным объектом настоящей работы является классическая («молочная») бактерия Propionibacterium freudenreichii (Pfr, ПКБ), поэтому именно ей мы уделяем внимание в настоящем обзоре.

Местообитания Pfr — молоко и молочные продукты: свежее коровье молоко [Cummins, Johnson, 1981; Fessier et al., 1999 (a)], кисломолочные продукты длительного хранения, например, сброженная жирная сметана (каймак)[Шакирзянова и др., 2002], «твердые» и «полутвердые» сычужные сыры (индигенная микробиота, ПКБ) с высокой температурой второго нагревания (52 — 55°С), которые долго созревают (до 3-х месяцев и более) при пониженной температуре [Cummins, Johnson, 1981; Fessier et al., 1999 (b)]. Источником Pfr являются также сброженные травы, силос [Воробьёва, 1995; Merry, Davies, 1999].

В каймаке, сырах и силосах классические ПКБ имеет трофическая связь (образуют трофическую цепь) с молочнокислыми бактериями, которые предварительно сбраживают углеводы (лактозу, глюкозу, мальтозу) с образованием молочной кислоты, которую в форме лактатов ПКБ используют в качестве источников углерода и энергии.

Подходящие («богатые») натуральные среды для культивирования Pfr в лабораторных и производственных условиях — это глюкозо- или лак- татно-кукурузная среда, лактатная молочная сыворотка и другие натуральные среды. Отдельные штаммы Pfr способны использовать лактозу, т. е. расти на обезжиренном молоке.

Вышесказанное свидетельствует о том, что Pfr тяготеет к пищевым субстратам, причем не вызывая порчи модифицируют их качество. Поэтому эту бактерию можно назвать «пищевым микроорганизмом».

 

1. Практическое значение Р. Freudenreichii применение и разработка новых, способов микробиологической защиты пищевых и сельскохозяйственных продуктов

1.1.Использование способности ПКБ подавлять портящие микроорганизмы биопротекторное действие и технологии биоконсервирования

 

Препараты на основе Р. Freudenreichii уже используются для- борьбы с патогенными или портящими микроорганизмами, т.е. консервирования продуктов. Актуальность применения, ПКБ состоит в. замене химических препаратов и антибиотиков на биологические, которые экологически предпочтительны.

Так, был разработан биологический консервант «Микрогард» — пастеризованное снятое молоко после культивирования в нём Propionibaterium freudenreichiis ubsp. shermanii.Этот консервант был официально утвержден для использования в продуктах типа домашнего сыра и йогурта. По некоторым данным, примерно 30% всего домашнего сыра в США производится с добавлением «Микрогарда». Препарат ингибирует рост грибов, дрожжей и грамотрицательных бактерий. Считают, что антимикробную активность этот консервант проявляет за счет наличия в нем пропионовой кислоты/пропионата, ацетата, а также особого пептида [Ayres et al., 1992; Holo et al., 2002]. Препарат представляет собой пастеризованное снятое молоко, которое подкисляют до pH 5,3 и культивируют на нем Р. Freudenreichii ssp. shermanii(АТСС 9617) в течение 48 часов. Затем препарат нейтрализуют, пастеризуют и замораживают [Ayres et al., 1992]. Следует отметить, что используемое значение pH препарата оптимальным для развития P. Freudenreichii не является [Воробьёва, 1995]. Поэтому не удивительно, что «Микрогард» содержит менее 0,02% пропионовой кислоты/пропионата этого недостаточно для подавления микробного роста. Антимикробным действием, по-видимому, обладают метаболиты с молекулярной массой больше 300 Да, подверженные действию протеолитических ферментов. «Микрогард» подавляет рост многих исследованных грибов, например, Penicillum exvansum OSU, Blackyeast ,Kluyvermyces marxianus 8554, но не всех. Нечувствительность некоторых грибов (Aspergillus niger OSU, YeastY) может быть связана с действием их протеолитических ферментов. Минимальная ингибирующая концентрация для разных микроорганизмов различается. Она колеблется от 1% (для Ps. putida, Yersini asp., Aeromona ssp., Salmonella paratyphi) до 3%(Ps. Aeruginosa ATCC419, S. typhimurium) [Al-Zoreky et al., 1991]. Действие препарата очень сильно зависит от состава того или иного пищевого продукта [Ayres et al., 1992 ].

Другой коммерческий препарат «Биопрофит» содержит L. Rhamnosus и Р. fi-eudenreichii.Этот продукт используется для подавления роста дрожжей в молочнокислых продуктах и бацилла в хлебной закваске. Ингибирующий эффект обусловлен совместным действием двух штаммов [Al-Zoreky, 1991].

Подробно о применении Р. Freudenreichii в производстве «твёрдых» сыров типа «Швейцарского», в производстве витамина В₁₂ и пропионовой кислоты микробного происхождения, а также в составе заквасок при силосовании трав на корм скоту можно прочитать в книге Воробьевой Л.И. [Воробьева, 1995]. Одна из разработок с использованием подсырной сыворотки и Pfr подвида shermanii, а также смешанных культур, позволила получать пропионовую кислоту в концентрации 1,6 — 2,2% [Bodieetal., 1987]. Другая — с использованием последовательного культивирования сначала термофилов Lactobacillus bulgaricus и Streptococcus thermophilic на под- сырной лактозной сыворотке, а затем ПКБ, использующей лактат, обеспечивала образование 2,6% пропионата[Ahernetal., 1987].

Все современное производство высококачественных сыров в мире включает, использование штаммов ПКБ. Сыры — это, прежде всего, консервирование молочного белка, казеина. В России, как и в Мире в целом, пропионовокислые бактерии как заквасочные (стартерные) культуры в производстве сыров применяют с конца 80-х — начала 90-х годов прошлого столетия. Для созревания» сыра (формирования его структуры, органолептических свойств и биологической ценности) абсолютное значение имеют соединения, выделяемые бактерией. Это прежде всего продукты пропионовокислого брожения: углекислый газ, пропионовая и другие летучие кислоты, их альдегиды, ацетон, диацетил и пропанол, а также диметилсульфид. Пролин и свободные нукпеотиды, выделяемые пропионовокислыми бактериями, создают специфический вкус сыра. «Настоящие» сыры, помимо их вкусовой привлекательности, продукты — весьма полезные для человека, благодаря биологически активным веществам, образуемым именно ПКБ. Среди них — незаменимые аминокислоты (метионин, пролин), свободные нуклеотиды, витамины группы В, в том числе фолиевая кислота и следы витамина B₁₂, нуклеотиды и нуклеозиды, естественные актимикробные факторы (пропионаты, пропионицины) и противовирусный антибиотик (пропионин), а также другие пептиды, в частности с антимутагенными и реактивирующими свойствами [Иконников и др., 1982; Воробьёва,. 1995; Hugenholtzetal., 2002; Рыжкова, 2003].

Таким образом, благодаря именно пропионовокислым бактериям высококачественные сыры являются продуктом, пищевые и биологические свойства которого превосходят молоко и молочные продукты, хотя сыроделие возникло в глубокой древности, и по сути таковым является сейчас, как способ консервирования молочного белка. Технологии производства сыра с применением заквасочных (стартерных) культур ПКБ, которая начала активно применяться в 90-годы прошлого века, а также о проблемах такого применения посвящена большая статья специалистов из Швейцарии [Frцhlich-Wyder et al., 2002].

Любая микробиологическая биотехнология подразумевает выявление эффектов микроорганизма(ов), их изучение и разработку (оптимизацию) способа введения в тот или иной пищевой продукт. По нашим представлениям, ПКБ как источник пропионатов и бактериоцинов (пребиоти- ков и нутрицевтиков) можно применять тремя способами:

• в качестве биодобавки, т.е. выращенной культуры или культу- ральной жидкости, содержащей нужные экзометаболиты, не растущей и не ферментирующей субстрат;
• в качестве ферментирующей углеводы или лактат с образованием пропионата суспензии клеток: не растущая культура (отделённые, в том числе иммобилизованные, живые или пермеабилизованные клетки);
• в качестве растущей культуры ПКБ при совместном культивировании действующего микроорганизма (дрожжей, МКБ) и ПКБ. Это возможно в микробиологическом производстве, когда микроорганизм используют общий субстрат или наблюдается трофическая связь или кометоболизм (МКБ- ПКБ).

Вместе с тем, иногда исходят из общих представлений о полезных свойствах ПКБ, почерпнутых из литературных источнков, и вносят их в пищевой продукт механически без выявления их реальной активности (жизнедеятельности или метаболического вклада). В последнее время в России запатентовано достаточно много изобретений по внесению культур ПКБ в пищевые продукты (табл. 1), однако надежность описываемых в изобретениях результатов по применению ПКБ, на самом деле, может быть невысокой.

Основной проблемой, возникающей при включении ПКБ в состав комплексной закваски, является их взаимодействие с другими заквасоч- ными культурами. Как уже было сказано, ПКБ растут медленнее, чем большинство молочнокислых бактерий и достаточно чувствительны к снижению рН среды, которое они вызывают. Поэтому усовершенствование технологий приготовления заквасок с ПКБ должно быть направлено на обеспечение активности культур ПКБ в процессе создания продукта.

Примерами выявления эффектов, их изучения и тщательных разработок для получения новых пищевых продуктов с использованием ПКБ, которые базируются на собственных исследованиях, являются работы группы A. Babuchowski (Польша, Университет г. Олыптин). Исследовали последствия введения (и инкубирования) ПКБ в овощные продукты, в том числе предварительно ферментированные с помощью МКБ (сквашенная- капуста), смешанные свежие салаты, состоящие из разных овощей, и овощные соки, например, сок красной свеклы. Оценивали способность к развитию классических ПКБ разных видов, образование ими пропионовой и уксусной кислот, обогащение нутрицевтиками (витамином В₁₂ и фолиевой кислотой), состав микробиоты по КОЕ, органолептические свойства продуктов и сроки хранения. Получили положительные результаты, показывающие перспективность применения ПКБ для обработки овощной продукции.

Таблица 1.Пропионовокислые бактерии в составе «коктейлей», предлагаемых для пищевой промышленности

Установили благоприятные новые вкусовые качества овощных продуктов, снижение содержания вредных микроорганизмов, а также то, что эффект ПКБ в ферментированных молочнокислыми бактериями продуктах, в том числе в отношении обогащения продукта (кислой капусты) нутрицевтиками, проявляется при их длительном созревании. Эффекты зависели от применяемых штаммов ПКБ [Babuchowskietal., 1999].

Далее эти подходы были применены при исследовании сбраживания смеси соков томата и корней петрушки с помощью P. Freudenreichii и Р.acidipropionici,которые вводили в количестве 10⁹ КОЕ/мл и инкубировали 48 ч при 30°С в анаэробных условиях. Разные штаммы ПКБ росли на смеси по-разному. Оценивали концентрации пропионовой и уксусной кислот, витамина В12, содержание живых клеток ПКБ в ферментированной смеси соков, а также их антимикробную активность в отношении Salmonella sp. и Listeria monocytogenes. Заключили, что некоторые (отобранные) штаммы ПКБ следует использовать для сбраживания данной смеси соков, поскольку увеличивются сроки хранения, продукт обладает антимикробными свойствами и в целом полезен для здоровья человека [Laniewska- Troekenhemetal., 2004].

Культивирование P. Freudenreichii на овощных соках (морковном и сельдерея) исследовали с целью получения полисахаридов микробного происхождения,, которые могут быть использованы в пищевой промышленности для увеличения вязкости жидких продуктов [Dobruchwskaetal., 2004]. Польские авторы [Warminska-Radykoetal., 2004] попытались также получить положильный эффект от введения в йогурты суспензий пропионо-вокислых бактерий.(5% об.,, 10⁸ КОЕ/мл). Сообщили, что качественные характеристики модифицированных йогуртов, полученных с применением стартерных культур: L. Delbrueckii ssp.bulgaricus и Streptococcus thermophilus, практически не изменялись после введения суспензий Р. Freudenreichii Т 109 и P.thoenii Т 112 и Т 120. Эти штаммы обладали высокой антибактериальной активностью против Е. coli и Y. entercolitica.Наблюдали увеличение продолжительности жизни не только стартерных культур, но и введённых в йогурты бифидобактерий: В. Breve Т 109 и В.animals 22.

Следовательно, достигался эффект сохранения продукта с помощью

ПКБ. При этом йогурты обогащались витамином В₁₂ (скорее всего за счет внутриклеточного витамина ПКБ).

Мы должны заметить, что в экспериментах с йогуртами пропионово- кислые бактерии как суспензия свободных от среды и неразмножающихся клеток — скорее пассивная биодобавка (подобно бифидобактериям), чем агент формирования продукта: ПКБ не могут развиваться в йогурте (кислая среда и дефицит подходящего источника углерода после развития МКБ), а также активно выделять экзометабаолиты (ЛЖК и нутрицевтики). Скорее всего, ПКБ, сохраняя жизнеспособность, осуществляют свой основной метаболизм за счёт внутренних субстратов, и проявляют слабую функциональную активность (ЛЖК, нутрицевтики). Здесь важнее то, что в йогурты вводятся и сохраняются живые клетки-пробиотики (ПКБ, наряду с бифидобактериями), которые как живые клетки, попадая в организм человека, могут функционировать (по-разному) в его ЖКТ.

 

1.2.Микробиологическая защита пшеничного хлеба от «картофельной болезни» с помощью Propionibacterium freudenreichii.

 

Хлеб — важнейший продукт питания народов Европы, Америки, Азии и других континентов. Исключение составляют народы, употребляющие рис вместо хлеба (Китай, Япония и др.). Его сохранность устойчивость к микробной деструкции (порче) всегда актуальна. В теплых и влажных краях даже свежевыпеченный хлеб очень быстро (в течение 2-х суток хранения) заболевает «картофельной болезнью», обусловленной развитием гнилостной микробиоты в мякише, которое превращает его в слизистый сгусток(рис. 6). Это обусловлено присутствием в муке спор бактерий Р.Bacillus (В. subtilis,В. mesentericus, В. Cereus и др.) в концентрации 10 — 1000 на 1 г муки. При их прорастании происходят большие потери хлеба [Pelshenke, 1950; 1954; Воронцова, 1971 (а, б); Kaur, 1986; Богатырева и др., 1993; Odame-Darkwah, Marshall, 1993; Suomalainen, Mayramakinen, 1999; Богатырева, 2000, Pepe et al., 2003].

В ряде «теплых» стран, в том числе в Южной Африке и Испании, исследуют эффекты органических кислот химического происхождения (уксусная, молочная, пропионовая кислоты, их кальциевые соли, а также композиции солей) с целью применения для защиты хлеба при сохранении активности дрожжей. Наибольший положительный эффект проявил пропио- нат кальция [Pattisonetal., 2003]. При этом в США уже производят хлеб длительного хранения, который содержит химический пропионат (он продается и в Москве). Отметим, что в России давно, [Моргун и др., 1973] был предложен защитный химический препарат против бациллярного поражения хлеба на основе ацетата натрия — аналог «Ропала», выпускаемого в ФРГ фирмой «Берингер Зон». Против поражения хлеба мицелиальными грибами предлагают использовать также сорбат калия [Guynotetal., 2005(а)],действие которого сравнивали с таковым бензоата и пропионата при рН в области 4,5 — 5,5 и установили, что химический сорбат калия предпочтителен [Guynotetal., 2005 (b)].

Преимущества микробиологической защиты хлеба заквасочным способом очевидны отсутствие вредных химических примесей, возможность введения кислот (солей) как антимикробных агентов вместе с клетками (возможно, пробиотиками), обогащение хлеба нутрицевтиками и пребио- тиками.(но не в случае МКБ).

С одной стороны, имеется возможность ввести непосредственно в тесто готовый биопрепарат ПКБ, отдельно полученный в специальном производстве, а с другой — применять закваску. Заквасочный способ имеет дополнительные преимущества он экономичен и технически удобен (не является трудоемким нет необходимости создавать отдельное производство биопрепарата при участии специального обслуживающего персонала; используется то же сырье, что и для приготовления теста).

Этот способ накопления антимикробного препарата можно применять непосредственно на хлебозаводах, но при одном условии возможности культивировать бактерию как источник экзометаболитов на мучной среде. Подходы для борьбы с «картофельной болезнью» ранее разрабатывались: существует заквасочная технология с использованием некоторых штаммов молочнокислых бактерий, выделяющих молочную кислоту [Афанасьева, 2003; Богатырева, 2000; Pepe et al., 2003]. Однако, пропионо- вокислые бактерии, образующие пропионаты, считаются более перспективными антибациллярными агентами.

Пропионовокислые бактерии (ПКБ) известны как активные продуценты пропионовой­ кислоты (ее солей) и ряда других антимикробных фак­торов уксусной кислоты, диацетила, пропионицинов. Показано, что экзо- метаболиты ПКБ способны активно подавлять рост бацилл. Вместе с тем ПКБ слабо подавляют рост таких микроорганизмов, как дрожжи и молоч­нокислые бактерии, используемые в хлебопекарном производстве [Odame- Darkwah, Marshall, 1993; Данилова и др., 2006].

Первые попытки применения ПКБ в хлебопечении с целью микробиологической защиты пшеничного хлеба от плесневания и «картофельной болезни» за счет выделяемых кислот (уксусной и пропионовой) были предприняты еще в. 50-х годах прошлого века [Pelshenke, 1950; Pelshenke, 1954 а, б]. Автор приготовил закваску (т.е. предварительно инкубировал ПКБ неизвестного штамма на мучной среде без пассирования), ввел её в тесто, содержащее дрожжи. Хлеб после выпечки имел повышенную устойчивость к микробному поражению.

Исследования далее продолжались в Польше, Финляндии, России, и других странах [Воронцова, 1971 (а, б); Majehrzak et al, 1977; Kaur, 1986; Javanainenetal., 1987; Al-Zorekyetal., 1991; Богатырева, Иордан и др., 1993; Odame-Darkwah, Marshall, 1993; Suomalainen, Mayramakinen, 1999; Богатырева, 2000; Данилова и др., 2006]. Результаты научных исследований, полученные вышеперечисленными авторами, подтверждают целесообразность применения ПКБ для микробиологической защиты пшеничного хлеба от «картофельной болезни».

Так, установлено [Javanainen et al., 1987], что классические ПКБ (разные штаммы P. freudenreichii, P. acidipropionici, P. jensenii=technicum) способны осуществлять пропионовокислое брожение с образованием пропионовой (0,34%) и уксусной кислот на мучной среде (рН 7,0) после её обработки а-амилазой и добавления солей: сульфата аммония, фосфата калия, хлористого кальция, сульфата магния, а также дрожжевого экстракта. Образованные кислоты нейтрализовали с помощью порошка карбоната кальция. Рост бактерий на мучной среде не оценивали, но наблюдали подавление образования ЛЖК P. Acidipropionici в присутствии L. Plantarum (в смешанной культуре); при этом в среде возрастала концентрация лактата.

Комбинации отдельно выращенных Lactobacillus rhamnosus LC705 и Propionibacterium freudenreichii ssp. shermaniiJ S(10⁸/г клеток в тесте) были эффективны против развития бацилл и плесени в хлебе [Suomalainen, Mayramakinen, 1999].

Ранее,- еще в, 1993 году, американские исследователи пытались решить проблему потери хлеба в развивающихся странах, используя пропио- новокислые бактерии в тесте. Для этого исследовали взаимодействия между P. Freudenreichii ssp.shermanii, В. pumilus и Saccharomyc escerevisiae. Дрожжи как главный стартерный микроорганизм не должны были «страдать» от воздействия ПКБ. Испытания проводили при использовании полусинтетической среды и установили, что прорастание спор и рост вегетативных клеток бациллы сильно- подавлялось (бактериоцидное действие прежде всего на прорастание спор) после предынкубирования на ней ПКБ при 30°С в течение 13 часов. Дрожжи при этом были полностью жизнеспособны в. присутствии ПКБ [Odame-Darkwah, Marshal, 1993].

Влияние ПКБ на рост дрожжей могло быть отрицательным (соотношение клеток в инокуляте — 40:1), нейтральным (соотношение 12:1) или позитивным (соотношение 3:1). Также было показано, что культуральная жидкость молодой (18-24 ч роста) культуры ПКБ стимулирует рост дрожжей. Антимикробный агент ПКБ, пропионат, вплоть до концентрации 1,5% позволял дрожжам рати, но полностью подавлял развитие бацилл. Последнее является опеделяющим в применении пропионата (в том числе в составе культур пропионовокислых бактерий) для защиты хлеба от «картофельной болезни» [Данилова и др., 2006].

Показанные выше эффекты ПКБ в защите хлеба должны быть учтены и применены в производстве хлеба. Однако, для применения в реальном производстве важны не только эффекты, но способы и технологические параметры введения препарата в тесто (концентрация инокулята, концентрация пропионата, инградиенты среды, их концентрации и т.д.). Это особенно важно для крупномасштабного производства.

Можно получать пропионовую кислоту/пропионаты микробиологического происхождения, и вводить их в тесто в нужной концентрации для защиты хлеба от бациллярной атаки. Однако экономичнее не удалять клетки, а использовать цельную культуру ПКБ, тем более, что она содержит нутрицевтики, выделяемые ПКБ. Можно вырастить культуру ПКБ отдельно на подходящей среде, затем ее сконценрировать и ввести в тесто в соответствии с необходимой концентрацией пропионатов. Но это требует отдельного производства (цеха) и дополнительных затрат труда.

Особенностью и традицией хлебопечения в России является применение так называемых заквасок, вносимых в дрожжевое пшеничное тесто в момент его замешивания. Закваски — это, по сути, продукт предварительного инкубирования заваренной и осахаренной пшеничной муки с определённым микроорганизмами или их композициями. Технология заквасок успешно развивалась в СССР и актуальна в современном производстве,

поскольку ведет к позитивным результатам как в отношении качества хлеба, его биологической ценности, так и удешевлению производства [Афанасьева, 2003; Богатырева, 2000]. До середины 80-х годов для этой цели применяли только чистые культуры молочнокислых бактерий. Образование ПКБ пропионатов в закваске послужило основой для разработок способов защиты хлеба с помощью пропионовокислых бактерий. Они должны развиваться на мучной среде, причем так, чтобы было реально периодическое двукратное разбавление свежей средой по крайней мере в течение суток. Вместе с тем оказалось, что развитие ПКБ, в отличие от МКБ, на мучной среде затруднено (лимитировано).

По данным Воронцовой [1971 (б)] ограниченное перидическое культивирование ПКБ было возможно только на весьма «богатой» и при этом стерилизованной мучной среде. Мучную среду обогащали глюкозой (1,5%), прессованными дрожжами (2%), кукурузным экстрактом (0,5%), гидрофосфатом калия (К₂НРО₄, 0,2% ) и нейтрализовали до рН = 7,0. Для производства хлеба эти условия — уже существенное удорожание, включая стерилизацию среды в большом объёме. При этом пшеничная мука, надо принять к, сведению, содержит аминокислоты, в том числе-незаменимые, витамины и микроэлементы [«Химический состав пищевых продуктов» М.Пищевая промышленность. 1979; 247с.], что должно было обеспечивать рост ПКБ без какого-либо обогащения заваренной и осахаренной мучной среды.

Сотрудники кафедры микробиологии МГУ и ГосНИИ Хлебопекарной промышленности (Россельхозакадемия) в свое время [Богатырева и др., 1993; Богатырева, 2000] предложили заквасочный способ введения ПКБ в дрожжевое пшеничное тесто. Он обеспечивал: 1) значительное увеличение устойчивости пшеничного хлеба к заболеванию «картофельной болезнью» даже по сравнению с МКБ; 2) улучшение его органолептических свойств (сдобный аромат и вкус); 3) увеличение объема хлеба(рис. 7); ускорение созревания теста, т.е. снижение расхода прессованных дрожжей. Способ включал: введение в мучную среду (осахаренную «заварку») активированной после лиофилизации ПКБ(P. Freudenreichi issp. Shermanii ВКМ 103) в количестве 200-400 мг (АСБ) на 100 г мучной среды, которая на первых этапах была дополнена кукурузным экстрактом и хлористым кобальтом (последний важен для биосинтеза витамина В₁₂), инкубирование и двукратное разбавление первичной закваски свежей мучной средой в несколько этапов.

Позже стало понятным, что можно снизить концентрацию соли кобальта на порядок, поскольку для пропионовокислого брожения достаточны малые количества внутриклеточных корриноидов (1,0 — 10 мкг/г АСБ) по сравнению с естественным высоким (1000 мкг/г АСБ) уровнем их образования в клетках бактерии. Последний достижим при концентации соли кобальта в среде ОД мг/л [Рыжкова, 2003].

Предложенный способ был испытан на многих (14-ти) хлебозаводах России и стран СНГ с положительным результатом. Однако в производственных условиях возникала проблема нестабильности ПКБ- «закваски» при длительном ее ведении, а именно при многократном разбавлении вдвое свежей мучной средой («заваркой» без обогащения) с целью накопления нужного количества «закваски». Ценные свойства «закваски» постепенно утрачивались в результате, по-видимому, «вымывания» клеток ПКБ при разбавлении мучной средой. Это означало, что минимальная мучная среда (оМПЗ, т.е. осахаренная мучная «заварка» без добавок) не обеспечивает воспроизведение культуры ПКБ в накопительном производственном режиме.

 

Последовательное культивирование МКБ и ПКБ на мучной среде теоретически возможно, поскольку лактат является естественным субстратом для развития ПКБ (трофическая цепь, действующая, например, при созревании твёрдых сыров высшего качества), а мучная среда может быть модифицирована благодаря активным протеолитическим ферментам МКБ. По данным Пивето с сотрудниками термофильная МКБ —Lactobacillus helveticus,стимулирует рост P. Freudenreichii на молочной среде благодаря образованию ею особых пептидов из казеина молока [Piveteau et al., 2002].

В связи с вышесказанным целью настоящей работы явилось обнаружение действия исследуемых штаммов классических пропионовокислых бактерий (Р.Propionibacterium) в качестве пробиотиков, начальное изучение их пробиотически значимых свойств и разработка новых способов защиты пшеничного хлеба от гнилостного поражения.

---

Страницы:   1   2