Пробиотический потенциал штаммов. Часть 2.

Страницы:   1   2

---

ГЛАВА II. Разработка способов применения P. Jreudenreichii для защиты пшеничного хлеба от «картофельной болезни», вызываемой развитием бацилл.Объекты, материалы и методы исследования.

2.1. Оценка антиоксидантной активности жидких культур штаммов

 

P. freudenreichii RVS-2-ims (I Рг 2) и P. freudenreichii RVS-4-Irf-(II, Рг 4).

Бактерии культивирули на мСС 72 ч при 30°С при свободном доступе воздуха и при периодической нейтрализации образуемых кислот [Данилова и др., 2006]. Выращенные культуры хранят при 6°С. Образцы для анализа должны быть нейтральными (рН 6,8-7,0). Концентрация живых клеток в конце культивирования измеряют ((3-4) х 10⁹ КОЕ/см³).

Для измерения антиоксидантной активности ПКБ использовали электрохимический метод катодной вольтамперометрии. Методика эксперимента заключается в получении вольтамперограмм катодного восстановления кислорода с помощью портативного программируемого анализатора «Антиоксидант» (фирма «Полиант», г. Томск).

Электрохимическая ячейка прибора представляет собой стеклянный резервуар, в который последовательно помещают фоновый электролит и анализируемые образцы биопрепаратов. В качестве фонового электролита был выбран фосфатный буфер (рН 6,86). В электрохимической ячейке находится индикаторный ртутно-пленочный электрод, хлорид-серебряный электрод сравнения и хлорид-серебряный вспомогательный электрод. Объемы отбираемых проб составляют 0,1; 0,5 и 1,0 мл. Образцы перемешиваем с помощью магнитной мешалки.

Антиоксидантную активность образцов определяем используя метод катодной вольтамперометрии, а именно процесс электровосстановле-ния кислорода, ЭВ О₂. В его основе лежит модельная реакция ЭВ О₂, протекающая на индикаторном электроде по механизму, аналогичному восстановлению кислорода в тканях и клетках организмов, способных к кислородному дыханию.

В данном способе регистрируется одноэлектронное восстановление кислорода с образованием активных кислородных радикалов (0₂). Предполагается, что антиоксиданты, имеющие восстановительную природу, реагируют с кислородом и его активными радикалами на поверхности индикаторного электрода, что отражается в уменьшении катодного тока ЭВ О₂ на ртутно-пленочном электроде в области потенциалов от 0 до — 0,7 В. Описанным выше вольтамперометрическим методом исследуем антиоксидантные свойства образцов двух анализируемых культур ПКБ и среды, на которой культировали бактерии, в качестве контроля. Рассчитываем значения кинетического критерия антиоксидантной активности для исследуемых образцов жидких культур ПКБ.

В этой части работы использовали штамм P. freudenreichii RVS-4-irf (Pr 4) как наиболее активный по кислотообразованию и синтезу корриноидов, который в лаборатории культивируется на одной из сред:

Среда пСС-Б (г/л): глюкоза — 25; триптон (пептон) — 1,0; (МН₄)₂SO₄ — 3,0; КН₂РО₄ — 1,0; MgS0₄-7Н₂0 — 0,25; кукурузный экстракт — 1,0; микроэлементы (мг/л): МnS0₄ -5Н₂0 — 5,0 или МnС1₂-4Н₂0 — 4,0; ZnS0₄-7Н₂0 — 0,01; FеС1₃-6Н₂0 — 0,005; СоС1₂*6Н₂0 — 0,1 мг; вода дистиллированная; рН 6,8-7,0.

Среда В отличается от пСС-Б тем, что кукурузный экстракт заменяем тремя витаминами и содержит (мкг/л): пантотенат кальция — 1000; тиамин-200; биотин 1,0.

Мучная среда 1 (оМПЗ) или «осахаренная» мучная пшеничная заварка. Для приготовления оМПЗ пшеничную 2 сорта заваривают водой с температурой 85 — 90° С (соотношение мука : вода= 1:3). После охлаждения заварки до 55°С вносятся ферментные препараты а-амилазы (Bakezyme P500BG, пр-во фирмы DSM, Германия) и глюкоамилазы (Bakezyme AG800BG, пр-во фирмы DSM, Германия) в количестве 0,001% и 0,01% к массе муки в заварке соответственно. Продолжительность осахаривания при температуре 55° С 1,5 часа.

Мучная среда 2 (MC 2)

Среду готовят путем заваривания муки кипящей дрожжевой водой (Практикум по микробиологии, 2005) в том же соотношении и после охлаждения обрабатываем амилазами, как описано выше, а также протеолити- ческими ферментами (DSM Bakery Ingredients; Bakezyme В 500 (нейтральная бакт. протеаза); дозировка: 0,5 — 3,0 г/100кг.

Экстракт мучной среды (ЭМС)

Для приготовления ЭМС мучную заварку, оМПЗ, центрифугируем на центрифуге Beckman (США) 45 мин при 9 тыс. об/мин. Полученный супернатант ещё раз центрифугируют 30 мин при 9000 об./ мин. В результате получаем прозрачный раствор, сводный от нерастворимых веществ оМПЗ. Культивирование Pfr на среде пСС-Б проводим в пробирках 20×2 см при заполнении их 20 мл среды при свободном доступе воздуха. Температура культивирования составляет 30°С.

КЖ Pfr Рг 4 получаем центрифугированием культуры при 30000g в течение 15 мин, стерилизуем фильтрованием через мембранный фильтр «Synpor» №6 («Chemapol», Чешкая Республика) и вводили в ЭМС в количестве 10% (по объему). ЭМС содержит споры В. subtilis 40 и В. cereus 9 в момент посева. Контролями служат варианты без добавления КЖ, но с добавлением стерильной среды (контроль на изменение объема).

Световую микроскопию фиксированных окрашенных препаратов бактерий на мучной среде, проводят с помощью микроскопа Laboval-4, Zeiss, Germany. Компьютерное изображение получаем с помощью микроскопа Axioskop (Zeiss, Germany) системы автоматического анализа изображений KS 300, Zeiss (Germany). Увеличение при съемке х1000.

Статистическую обработку полученных результатов выполняют с % применением разных подходов в зависимости от количества повторных измерений. Среднее арифметическое значение со стандартным отклонением вычисляют в опытах с большим количеством вариант (программа SigmaPlot 3.02). Медиану (Me), т. е. среднее по величине показание, с максимальным отклонением (в %), используют в экспериментах с тремя повторностями [Венчиков, Венчиков, 1974].

Классические («молочные») пропионовокислые бактерии Р.Propionibacterium) служили объектами настоящей работы. Изоляты получены из «Швейцарского» сыра (Швейцария) в конце 80-х годов и фенотипически охарактеризованы как пропионовокислые бактерии в группе Е.П. Рыжковой (каф. микробиологии, МГУ имени М.В. Ломоносова). Изоляты (колонии) получали в анаэробных условиях на твёрдой селективной среде, содержащей лактат натрия, триптон, дрожжевой экстракт и соли по предложенному ранее методу [Cummins, Johnson, 1981].

Штаммы обладают общими свойствами, но их колонии различаются по цвету и размерам, а клетки по форме и размеру, физиолого- биохимически они различны по потребности в углеводах и ростовых факторах, несколько различаются их молекулярные характеристики: молярный % ГЦ-пар в ДНК.

Общие свойства: аэротолерантные анаэробы (или микроаэрофилы, что проявляется на жидких средах), грамположительные плеоморфные неподвижные палочки, лежащие под углом друг к другу («прищепки»), не формируют спор. Культуры образуют пропионовую и уксусную кислоты (соотношение ПК:УК ~ 2:1), синтезируют корриноиды, сбраживают моносахара, глюкозу, фруктозу, маннозу, галактозу, а также лактат, пируват, глицерин. Разжижения желатина нет (под вопросом штамм №7). Все штаммы каталазоположительны. ДНК хромосом имеет высокий молярный процент ГЦ-пар. Некоторые штаммы сраживают лактозу. Культуры растут на жидких средах при свободном доступе воздуха (без перемешивания). Оптимальное заполнение сосуда — 70% по объему. Оптимальная температура для роста 28-30°С. Клетки погружаются в толщу жидкости (на вторые-третьи сутки роста вблизи поверхности жидкой среды образуется прозрачное «кольцо» среды). Растут на поверхности твердых сред в анаэробных условиях.

Культурально-морфологические и некоторые другие различия позволяю подразделить изоляты Propionibacterium на 7 штаммов: Pr1 — Рг 7.

Pr1: клетки — палочки размером 0,6 х 2-3 мкм, колонии гладкие выпуклые с ровными краями бежевого оттенка размером 0,8-2,0 мм. Проявляют слабый рост на среде с лактозой и отсутствие роста на средах с крахмалом, мальтозой и сахарозой. Способен расти на средах с рамнозой, ксилозой и рафинозой. Образует мало кориноидов (30 — 50 мкг/г АСБ). Восстанавливает нитраты до N₂.

Pr2: палочки размером 0,5 х 1-3 мкм (среди них есть более длинные, до 3-5 мкм, с редким ложным ветвлением). Колонии гладкие выпуклые блестящие с ровными краями кремового оттенка размером 1,0-2,0 мм. Клетки погружаются в толщу жидкости, на дне пробирки формируется- рыхлый «клубок» биомассы. Культура сбраживает лактозу с активным ки- слотообразованием. Клетки чувствительны к лизоциму, содержат корри- ноиды (соединения группы витамина В₁₂): 600 — 800 мкг/г АСБ. Не восстанавливает нитраты. Содержание Г+Ц пар в ДНК = 67,1 (мол. %).

Рг 3: типичный размер клеток 0,5 х 1-2 мкм (встречаются длинные, до 3-5 мкм, иногда ветвящиеся неровные палочки). Колонии гладкие выпуклые блестящие с ровными краями светло-коричневого оттенка размером 0,8 — 2,0 мм. Штамм хорошо растет на лактозе. Рост на мальтозе, сахарозе и крахмале отсутстввует. Образует корриноиды ~ 500 мкг/г АСБ. Не восстанавливает нитраты.

Рг4 : неровные палочки, короткие (0,5 х 1-2 мкм), лежат под углом друг к другу без ветвления. Колонии гладкие выпуклые блестящие с ровными краями ярко розового цвета размером 0,8 — 2,0 мм. Штамм термоустойчив, выдерживает 52 — 55°С. Устойчив к NaCl (растет до концентрации 2%). Оптимальная концентрация глюкозы 2-4 %. На лактозе (мальтозе, сахарозе, крахмале) не растёт. Активное кислотообразование. Образует корриноиды (много) 1 ООО мкг/г АСБ и более. Не восстанавливает нитраты. Содержание Г+Ц пар в ДНК = 68,0 (мол. %).

Рг 5: неровные палочки достаточно длинные, до 3 мкм в длину. Колонии желтоватые, блестящие округлые до 2 мм в диаметре. Культура¹ не сбраживает лактозу, а также: мальтозу, сахарозу и крахмал. Образует корриноиды (~ 200 мкг/г). Нё; восстанавливает нитраты. Молярный процент Г+Ц пар в ДНК = 66,0.

Рг 6: короткие неровные палочки (0,5 х 1,0 мкм). Колонии коричневые или красные, блестящие округлые (1-2 мм). Лактозу сбраживает, од- накофост слабый: Hat других; дисахаридах; (мальтозе; сахарозе) и^ крахмале не растёт. Образует корриноиды (до 150 мг/г АСБ). Нитраты не; восстанавливает; Желатину не разжижает. Молярный процент Г+Ц пар в ДНК = 67,5.

Рг 7: короткие искривленные неровные: палочки (0,5 х 1,0 -1,5 мкм); без ветвления. Колонии кремовые, блестящие округлые (1-2 мм в диаметре). Культуры не используют лактозу в качестве источника углерода и энергии (а также мальтозу, сахарозу и крахмал). В клетках накапливаются корриноиды (до 800 мг/г АСБ). Желатину, возможно, разжижают. Нитраты восстанавливают.

 

2.2.Разработка способов примененияP. Jreudenreichii для защиты пшеничного хлеба от «картофельной болезни», вызываемой развитием бацилл.

 

Выше мы показали, что исследуемые штаммы P. Jreudenreichii (Р/г), выделяя в среду пропионовую кислоту/пропионаты и бактериоцин-подобные вещества (БПВ), эффективно подавляют развитие бацилл В. siibtilis и В. cereus. Именно эти гнилостные бактерии ответственны за порчу пшеничного хлеба, вызывая его «картофельную болезнь» (КБ).

Традиционная микробиологическая защита хлеба состоит в ведении в дрожжевое тесто молочнокислых бактерий. Молочная кислота (и низин) препятствуют развитию гнилостной микробиоты, однако действуют они только в кислых условиях (рН 3,5 — 4,5). Пропионаты и БПВ, в отличие от лактатов активны в нейтральной среде, хотя и в кислой среде пропионовая кислота в сочетании с уксусной, по литературным сведениям, — более сильный АНМФ, чем молочная [Taniguchi е1 а1., 1998]. При этом ранее в нашей лаборатории было показано, что S. cerevisiae — стартерная культура в производстве пшеничного хлеба, подобно МКБ проявляет устойчивость к пропионату [Данилова и др., 2006]. Все это делает перспективным применение ПКБ для защиты хлеба от гнилостной микробиоты. Важно также то, что Р/г, в отличие от МКБ, образует ряд веществ стимуляторов, ароматизаторов и нутрицевтиков-метабиотиков (см. табл. 1), которые обогащают хлеб, среди них витамины группы В, в том числе фолиевая кислота и витами В₁₂.

В обзоре литературы описаны ранние исследования, разработки и испытания в производственных условиях, направленные на применение ПКБ для защиты хлеба. Общим заключением явилось то, что ПКБ целесообразно использовать для этой цели. Задача состоит в разработке экономичного и удобного для производства способа внесения ПКБ в тесто перед замешиванием и инкубированием дрожжей (обычно около 1,5 ч).

В предварительных исследованиях устанавливаем технологически значимые параметры действия исследуемых ПКБ в защите пшеничного хлеба от КБ. Были определены действующие концентрации пропионата натрия (90% подавление развития бацилл) на мучной среде. Они оказались более высокими, чем на пСС-А,Б. Вместе с тем, стало понятным, что чем «богаче» среда, тем выше действующая концентрация пропионата, что не является неожиданным. Пропионаты в мучной среде эффективны против бацилл в концентрации 0,24 — 0,30 %. Далее подтверждаем, что культураль- ная жидкость P. Freudenreichii действительно эффективно (на 90%) подавляет развитие бацилл при условии ее внесения в мучную среду в количестве не менее 20 %. Измерение концентрации ЛЖК показывает, что при этом в мучной среде содержится 0,183% пропионата и 0,09% ацетата натрия, и этого оказалось достаточно для подавления прорастания спор бацилл. Наконец, учитывая безопасность классических ПКБ и их потенциальную пробиотическую значимость для человека, предложено не отделять клетки от культуральной жидкости, а использовать цельные культуры для внесения в тесто. Результаты представлены на рисунках 3.

 

В качестве модельной мучной среды используем водный экстракт оМПЗ, обработанной амилолитическими ферментами (ЭМС). Как видно из полученных результатов(рис. 3),90% подавление роста В. Subtilis достигалось при концентрации пропионата> 0,2 % при разном количестве вводимых спор (от 25 до 250 спор/мл среды). Такое количество спор бацилл обычно обнаруживают в пшеничной муке второго сорта. Споры В. cereus оказались более устойчивыми к пропионату, чем споры В. subtilis.

Для исследования влияния экзометаболитов P. Freudenreichiii на рост В. subtilis была использована культуральная жидкость (КЖ) 4-х суточной культуры ПКБ, выращенной на ГКС. Результаты исследования показывают, что действие КЖ почти не зависит от количества внесенных спор в пределах 25- 250 (спор/мл). При внесении КЖ (20% об./об.) к ЭМС, содержащую споры бацилл, наблюдали 90%-ное подавление роста В. subtilis (концентрация пропионата в среде — менее 0,2% ). Можно видеть, что КЖPfr оказывает даже немного более сильное действие на рост В. subtilis ,чем химический пропионат натрия в той же концентрации. Возможно, культуральная жидкость содержит и другие вещества, подавляющие рост бацилл. Ими могут быть соли уксусной кислоты, диацетил, бактериоцины.

 

2.3.Способы введения пропионовокислых бактерий в пшеничное тесто для достижения защитного эффекта.

 

1. Культуру P. Freudenreichii можно вырастить на одной из подходящих для применения в производстве хлеба сред, желательно пищевой и обеспечивающей эффективный рост биомассы и образование ЛЖК; затем, не отделяя клетки, культуру (клетки ПКБ + экзометаболиты в КЖ) ввести в дрожжевое тесто при замесе. К таким средам относятся, во-первых, ГКС или пСС-Б и во-вторых, вновь разработанные в нашей лаборатории натуральные среды, представляющие собой А. — обогащенную кукурузным экстратом (2%) лактозную сыворотку (для штамма Рг 2); обезжиренное молоко, обогащенное кукурузным или дрожевым экстрактом, после предварительного культивирования одной из МКБ: L. acidophilus, L. bulgaricus, L. Helveticus или S. Thermophilus (образование ПК до 1,4%); Б. — обогащенный экстракт мучной среды (ЭМС) с добавлением дрожжевого экстракта и других компонентов: гидролизата казеина и глюкозы. Выращенные культуры можно вводить в тесто в количестве 20% без отделения клеток, но при 10-кратном концентрировании для достижения защитного эффекта (0,2 — 0,3 % пропионата натрия к массе теста) в него достаточно ввести всего один-два процента препарата. Понятно, что эти способы не являются экономичными и удобными, т. к. среды достаточно дорогие, и требуется отдельное, независимое от хлебозаводов, производство препаратов ПКБ.
2. Привнесение в тесто компонентов той или иной среды, на которой выращена ПКБ, может и не ухудшать органолептические свойства теста (хлеба), однако само по себе обогащение хлеба дополнительными компонентами способствует росту бацилл и приводит к необходимости повышения концентраций пропионата-Ка. Поэтому был разработан способ приготовления препарата ПКБ, свободного от ростовой среды.

Культуру P. frendenreichii штамм Рг 4, выращенную в течение 96 часов на среде В (1 литр), центрифугировали (4000 об./мин, 20 минут), клетки суспендировали в водном растворе глюкозы (4 %, вода водопроводная, нестерильная) до концентрации клеток, равной 2,7 — 3,0 г АСБ в 100 мл раствора, и инкубировали (37°С) при периодической нейтрализации кислот (через 2 часа и более, ночь) до полного прекращения подкисления раствора. Подкисление происходило в течение 72 часов. В результате была получена суспензия клеток ПКБ в водном растворе пропионата с концентрацией 2,8 — 3,0 % (+ ацетат, соотношение 2:1, и остаточная глюкоза). А это означает, что при 10-кратном концентрировании суспензии клеток в водном растворе ЛЖК, достаточно введения примерно 1% этого препарата к весу (или объему) теста, чтобы достигнуть эффективной защиты хлеба от «картофельной болезни».

Экономичная и удобная заквасочная технология, которую традиционно

применяют на хлебозаводах России с использованием молочнокислых бактерий, подразумевает периодическое двукратное разбавление закваски (культуру бактерии, предварительно выросшей на жидком тесте, добавляют в дрожжевое тесто при замесе до начала его созревания, т.е. «подъёма») свежей мучной средой (оМПЗ) и инкубирование в течение периода времени 18-24 ч при 30°С. Это возможно, поскольку МКБ активно развиваются на мучной среде. После накопления в достаточном количестве (в геометрической прогрессии) МКБ-закваску вносят в конечное дрожжевое тесто в количестве 10% об. к массе муки. Этот способ удобен и экономичен в условиях крупномасштабного производства хлеба, поскольку нет затрат на самостоятельное (отдельное) производство заквасочных культур в больших количествах.

 

2.4. Применение водного экстракта мучной среды (ЭМС) в качестве искусственной среды при разработке заквасок на основе ПКБ.

 

Пропионовокислые бактерии в виде биомассы, вносимой в дрожжевое тесто, оказывают выраженный положительный эффект на хлеб: его сохранность, органолептические и нутрицевтические свойства [Богатырёва и др., 1993; Богатырёва, 2000]. Однако ведение закваски, т.е. накопление ПКБ путём поэтапного разбавления свежей мучной средой (оМПЗ) затруднено, поэтому такая ПКБ-закваска сохраняет свою антибациллярную активность недолго, выдерживая несколько разводочных этапов (циклов). В процессе производственных испытаний предположили, что ПКБ на обычной мучной среде (жидкое тесто = «осахаренная» мучная заварка, оМПЗ) не размножаются, а постепенно «вымываются» из теста в разводочных циклах инкубирования-разбавления. Трудная задача настоящей работы состояла в пытке «заставить» ПКБ (P. freudenreichii) расти на мучной пшеничной среде, причем так, чтобы удвоение биомассы бактерии происходило в течение не более 24 часов. Это диктуется условиями хлебопекарного производства.

Действительно, мы установили отсутствие стабильного роста культуры ПКБ на ЭМС. Для преодоления этого явления, т. е. для обеспечения роста ПКБ в мучной среде, обогатили ее компонентами полусинтеческой среды (пСС-Б) без глюкозы, но включая триптон, и добились удвоения биомассы ПКБ за 24 часа.

Данные, представленные на рис. 4, показывают циклическое (поэтапное) удвоение биомассы ПКБ на обогащённой ЭМС в нестерильных условиях после двукратного разбавления. Процедура приготовления закваски в модельной системе включала следующее: половину сырой биомассы (~ 1,5 мг/мл по АСБ) из 100 мл 96-ти суточной культуры на пСС-Б помещали в 100 мл нестерильной обогащенной ЭМС и инкубировали 24 часа. Биомасса возрастала вдвое. Затем после нейтрализации добавляли равный объём той же свежей мучной среды (рН 7,0), инкубировали и процесс двукратного разбавления/инкубирования повторяли.

В течение 5-ти циклов (этапов) сохранялась микрообиологическая чистота искусственной закваски. При этом концентрация пропионата в конце каждого этапа составляла ~ 0,6%. Для увеличения концентрации пропионата на последнем этапе накопления закваски (перед внесением в тесто) время инкубирования увеличивали до 48 часов. Концентрация пропионата возрастала до 0,8 %. Расчет показал, что при внесении такой закваски в дрожжевое тесто (20% к массе муки) после выпечки, когда происходит уменьшение объема материала, достигаемая концентрация пропионата (см. рис. 4) может препятствовать развитию бацилл в хлебе.

Таким образом, путем обогащения мучной среды (ЭМС) компонентами пСС-Б была разработана модель накопительной закваски на основе ПКБ для дрожжевого теста.

 

В естественных условиях, т.е. на натуральной мучной среде (оМПЗ) при её обогащении с помощью компонентов среды пСС-Б пропионовокислая закваска «работала» значительно дольше, чем без обогащения, однако всё-таки не удается избежать развития в ней контаминирующих бактерий (предположительно, это МКБ Р.Leiconostoc: очень мелкие палочки, сильно подкисляющие и ослизняющие закваску).

Эти бактерии из-за более высокой скорости роста вытесняют Pfr.Напомним, что к пропионату устойчивы не только дрожжи, что является благоприятным фактором в производстве дрожжевого пшеничного хлеба, но, к сожалению, в данном случае, и молочнокислые бактерии. Кроме того, нежелательно внесение в тесто компонентов среды пСС. Поэтому требовалась разработка нового подхода для получения закваски на основе ПКБ, защищенной от спонтанного развития именно МКБ.

Известно, что молочная кислота (рКа = 3,9) и высокая температура культивирования сами по себе существенны в нестерильной закваске в качестве антимикробных факторов, в том числе для подавления развития мезофиль- ной молочнокислой микробиоты[Barefoot, Nettles, 1993; Богатырева, 2000]. Для использования этого феномена с целью достижения микробиологической чистоты в нестерильных условиях трехсуточную культуру ПКБ, выращенную на ЛКС, соединяли в МКБ-закваской в соотношении 1:1 (по объему). Последнее очень важно для длительного поэтапного процесса накопления закваски. Процесс повторяли многократно. На последнем этапе приготовления ПКБ-закваски время инкубирования увеличивали до 24 часов. На всех этапах (кроме последнего) в конце инкубирования, т. е. через20 ч, концентрация ПК/пропионата составляла 148 ± 12 мМ (1,43% по пропионату), а УК/ацетата — 78 ± 5,5 шМ (0,65% по ацетату). На последнем этапе приготовления комплексной закваски (перед внесением её в дрожжевое тесто) содержание ПК/пропионата возрастало до 190 ± 18 мМ (~ 1,8 % по пропионату), а УК/ацетата — 93 мМ ± 14 мМ (0,77% по ацетату). Полученные значения молярных концентраций ЛЖК (и их солей) соизмеримы с таковыми в модельных экспериментах.

 

Следует отметить, что в отличие от модельного опыта на всех этапах накопления закваски на оМПЗ происходило её подкисление (примерно до рН 5,5), несмотря на нейтральный рН в начале инкубирования сразу после разбавления. Возможно, L. Delbrueckii способна гидролизовать крахмал и сбраживать глюкозу с образованием молочной кислоты при 30°С в отсутствие роста. Нельзя исключить также, что вновь образованная глюкоза является дополнительным источником пропионовой и уксусной кислот как продуктов брожения ПКБ. Подкисление закваски в целом благоприятно для активности пекарских дрожжей. После внесения комплексной закваски(L. delbrieckii + P. freudenreichii)в дрожжевое тесто, хлеб неизбежно обогащен витаминами группы В, в том числе фолиевой кислотой [Hugenholtzetal., 2002] и витамином В₁₂ [Богатырева, 1993], а также пролином [Воробьёва, 1995] и свободными нуклеотидами [Иконников и др., 1982].

Качество выпеченного хлеба с применением комплексной закваски превосходит таковое не только в контроле (без заквасок), но и в опыте закваска без ПКБ, на основе только одной L. Delbrueckii (рис. 6). Он приобретает больший объем за счет увеличения пористости, обладает приятным кисловато-ореховым вкусом и сдобным ароматом. Сроки «противостояния» хлеба «картофельной болезни» в камере ускоренного старения материала (37°С и высокая влажность) с применением комплексной закваски (МКБ+ПКБ) увеличивались в 4,0 — 4,5 раза по сравнению с вариантом без заквасок, и в 2 раза по сравнению с закваской с использованием L. Delbrueckii.

 

Таким образом, в результате проведенной работы разработаны основы новой технологии защиты пшеничного хлеба от поражения гнилостной микробиотой («картофельная болезнь») с помощью комплексной накопительной закваски, получаемой путем последовательного культивирования L. Delbrueckii и P. Freudenreichii на мучной среде (на основе их кометаболизма). Такая закваска может быть накоплена в больших количествах в результате её поэтапного двукратного разбавления свежей МКБ-закваской.

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

 

Ведется поиск новых штаммов, активных в отношении образования ЛЖК (пропионовой и уксусной кислот), бактериоцинов, витамина B₁₂и других биологически активных веществ. Propionibacterium freudenreichii является наиболее изученной и широко распространённой в природе. В сыром молоке коров и твёрдых сырах более 80% всех ПКБ составляет именно эта бактерия. Поиск новых штаммов Pfr,изучение их биологических свойств актуально в связи с проблемой пробиотиков. Эту бактерию в последнее время интенсивно изучают в качестве кандидата в пробиотики (пропионовокислым бактериям посвящают специальные международные симпозиумы). Сложность состоит в том, что она, по-видимому, истинным пробиотиком (эубиотиком) не является, а относится, скорее, к транзитор- ным.

Располагая штаммами классических пропионовокислых бактерий и их изолятов с использованием молекулярно-биологических методов и фило-генетического анализа идентифицируем их как Р. Jreudenreichii .

При этом исследуемые штаммы, имея общие признаки, заметно различаются фенотипически.

Необходимо провести более широкие испытания, пробиотического действия штаммов Р. Jreudenreichii на млекопитающих, а также клинические эксперименты с привлечением пациентов-добровольцев.

Все исследуемые штаммы Pjr после их предварительного инкубиро- вания в присутвии желудочного сока или эмульсии желчи оказываются способными к росту в жидких культурах. В модельном ЖКТ на примере штамма RVS-4-irf (Рг 4) установили, что ПКБ более чем на 60% (по logКОЕ/мл) сохраняет свою жизнеспособность.

Для всех семи исследуемых штаммов P. Jreudenreichii можно показать, что они индуцируют синтез разных цитокинов в цельной крови в системе ex vivo.Наибольший эффект нативных клеток ПКБ проявился в отношении образования интерлейкина ФНО (фактор некроза опухолей). В целом полученные данные по стимуляции синтеза цитокинов в крови человека показывают, что клетки классических («молочных») ПКБ способны воздействовать на иммунную систему человека.

Пропионат (натрия) как основной антимикробный фактор ПКБ по разному действовал на микроорганизмы-мишени бацилы, псевдомонады и кишечная палочка были высокочувствительны (эффект ингибирования роста зависел от состава среды), а МКБ:L. casei, L. acidophilus, L. brevis, L. fermentum, Streptococcus thermophilus,— достаточно устойчивы. Последнее характерно и для Saccharomyces cerevisiae.Наблюдения (наряду с известным стимулирующим действием ПКБ на рост бифидобактерий), обращают внимание на новую проблему: избирательность действия ПКБ в отношении разных микроорганизмов, в том числе присутствующих в желудочно-кишечном тракте. Можно допустить существование сообществ пробиотиков в ЖКТ и мутуализм между ними. Эти предположения требуют соответствующих экспериментальных подтверждений.

Научные предпосылки (сведения из литературы) и полученные нами данные свидетельствуют о широком спектре свойств классической ПКБ, которые имеют значения для проявления ее пробиотических эффектов, однако испытаний для выявления пробиотического действияР. Freudenreichii на животных проведено немного. Расширение таких исследований на животных и пациентах-добровольцах должно стимулировать разработку и применение пробиотических препаратов на основеP. freudenreichii.При этом пропионовокислая культура на нестерильной мучной среде (ПКБ-закваска) не должна быть вытеснена контаминирующей микрофлорой. Эта технологическая стратегия для ПКБ оказалась возможной только на основе трофической цепи: МКБ — ПКБ. Сами по себе пропионовые бактерии, не способны к росту на мучной среде. Вместе с тем, термофильная МКБ:L. Delbrueckii превращает глюкозу, но преимущественно мальтозу «осахаренного» жидкого теста (заварки), в молочную кислоту, которая, с одной стороны, подавляет развитие спонтанных бактерий (МКБ), а с другой — после превращения ее в лактат, является источником углерода и энергии для развития ПКБ. Этот простой (экономичный и удобный) способ позволил решить проблему защиты пшеничного хлеба от «картофельной болезни» при улучшении его органолептических, физических и нутрицевтических свойств. Предположительно хлеб обогащается биологически активными веществами, выделяемыми P. freudenreichii, а убитые нагреванием (при выпечке) клетки способны, возможно, оказывать иммунотропное действие (аналогия с P. jensenii 702).

 

ВЫВОДЫ.

 

Выявлены и частично изучены пробиотически значимые свойства исследуемых штаммов:

• иммунотропные (по стимуляции образования цитокинов в крови в системе ex vivo);
• избирательно антимикробные на основе пропионатов и бактериоцин- подобных веществ, действующих в нейтральных условиях;
• антиокислительные (показано для жидких культур методом катодной вольтамперометрии);
• экзометаболитные и экзоферментные (низкое внеклеточное содержание витамина B₁₂может быть существенным в сконцентрированных препаратах; протеолитическая активность проявляется как в кислых, так и в нейтральных условиях).

Изучен новый способ применения Р. Freudenreichii в заквасочной технологии производства пшеничного хлеба для его защиты от гнилостных бактерий («картофельной болезни» хлеба) он включает последовательное культивирование на мучной среде Delbrueckii и пропионовокислой бактерии.

 

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.

 

1. Афанасьева О.В. Микробиология хлебопекарного производства. — К.: Береста, СПб Ф ГОСНИИ ХП, 2003. С. 221с.
2. Белобородова Н.В., Белобородов С.М. Метаболиты анаэробных бактерий (летучие жирные кислоты) и реактивность макроорганизма // Антибиотики и химиотерапия. 2000. № 2. С. 28-36.
3. Богатырева Т.Г. Научные основы технологий хлебобулочных изделий с направленным культивированием микроорганизмов /Автореферат докторской диссертации. М. 2000.
4. Богатырева Т.Г., Иордан Е.П., и др. Способ предотвращения заболевания хлеба картофельной болезнью /Патент на изобретение № 1608849 от 17 июня 1992. Приоритет-29 сентября 1988 г.
5. Богатырёва Т.Г., Прянишникова Н.И., Иордан Е.П. Исследование про- теолитической активности молочнокислых, пропионовокислых бактерий и дрожжей, применяемых в хлебопечении // Межд. журнал Биотехнология у управление. 1994. Т. 1. № 4. С.40 -43.
6. Бонарцева Г.А. Об аэробном метаболизме пропионовокислых бактерий. Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук. М.: МГУ, 1973.
7. Брюхачёва Н.Л., Воробьёва Л.И., Бонарцева Г.А. Об* окислительном фосфорилировании у пропионовокислых бактерий // Микробиология. 1975. Т. 44. № 1. С. 11-14.
8. Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Марусина А.И., Турова Т.П., Кравченко И.К., Быкова С.А., Колганова Т.В., Гальченко В.Ф. // Микробиология. 2002. Т. №4. С. 1-9.
9. Быховский В.Я., Зайцева Н.И. Микробиологический синтез тетрапир- рольных соединений. Итоги науки и техники. М.: ВИНИТИ. Серия:

Биологическая химия, 1989. 176 с.

10. Венчиков А.И., Венчиков В.А. Основные приёмы статистической обработки результатов наблюдений в области физиологии. М.: Медицина, 1974. 152 с.
11. Воробьева Л.И. Пропионовокислые бактерии и образование вита mhhab_]2.М.: Издательство Московского университета, 1976. 264с.
12. Воробьёва Л.И. Пропионовокислые бактерии. М.: МГУ, 1995. 235с.
13. Воробьёва Л.И., Аль-Судани С., Краева Н.И. Пероксидазапропио- новокислых бактерий // Микробиология. 1986. Т. 55. № 5. С. 750- 753.
14. Воронцова К.Е. (а) Влияние пропионовокислых бактерий на жизнедеятельность картофельной палочки // Хлебопекарная и кондитерская промышленность. 1971. № 4. С. 14-17. С. 206-216.
15. Воронцова К.Е. (б) Использование пропионовокислых бактерий в хлебопечении // Хлебопекарная и кондитерская промышленность. 1971. № 6. С. 10-13.
16. Галактионов В.Г. Иммунология (3-е издание). М.: Издательский центр «Академия», 2004. 528 с.
17. Данилова И.В., Богатырева Т.Г., Быковченко Т.В., Рыжкова Е.П., Положительное действие Propionibacterium freudenreichii на рост Sac- charomyces cerevisiae при совместном культивировании // Прикладная биохимия и микробиология. 2006. Т.42. №3. С. 326-331.
18. Драчева Л. В. 2007. Антиоксидантная активность пробиотическихбиоантиоксидантов // Клиническое питание. № 1-2. 39.
19. Драчева Л.В., Короткова Е.И., Дорожко Е.В. Применение вольтаме- рометрического метода при изучении биоантиоксидантов //Пищевая промышленность. 2008. № 4. 28-29.
20. Иконников Н.П., Иордан Е.П., Воробьева Л.И. Выделение нуклеотидов и их производных иммобилизованными клетками Propionibacterium shermanii . // Прикл. биохим. и микробиол. 1982. Т. 8. № 1. С. 34-40.
21. Иконников Н.П. Образование органических кислот, нуклеотидов и их производных иммобилизованными клетками Propionibacterium Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук. М.: МГУ, 1984.
22. Канопкайте С.И. Кобаламины. Вильнюс: Мокслас, 1978. 144 с.
23. Канопкайте С.И., Рачкус Ю.А. Биохимические и медицинские аспекты кобаламинов (В₁₂). Вильнюс: Academia, 267с.
24. Краева Н.И., Воробьёва Л.И. Супероксиддисмутаза, каталаза и перок- сидаза пропионовокислых бактерий //Микробиология. 1981. Т. 50. № 5. С. 813-817.
25. Ленгерер И., Древе Г., Шлегель Г. Современная микробиология. Прокариоты (в 2-х томах). М.: Мир, 2005. Т. 1. С. 350, 383 -384.
26. Моргун К.Д., Ведерникова Е.И., Павлюк Р.Ю. Средства борьбы с картофельной болезнью // Хлебопекарная и кондитерская промышленность. 1973. № 11. С. 16 — 18.
27. Познанская A.A., Корсова Т.Л. //Успехи соврем, биол. 1980. Т. 90. № 1(4). С. 49-50.
28. Познанская A.A. Корсова Т.Л. //Успехи соврем, биол. 1984. Т. 98. № 3(16). С. 382-364.
29. Практикум по микробиологии п/р проф. А.И. Нетрусова. М.: Издательский центр «Академия», 2005. 606 с.
30. Рыжкова Е.П. Кобальт и корриноиды в биологии Propioibacterium Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук. М.: МГУ, 2003.
31. Рыжкова Е.П. Лекции для студентов 4-го курса каф. микробиологии МГУ (1992-2009).
32. Рыжкова (Иордан) Е.П. Множественные функции корриноидов в биологии прокариотических организмов //Прикл. биохим. и микробиол. 2003. Т. 39. № 2. С. 133-159 (обзор).
33. Рябичева Т.Г, Вараксин Н.А., Тимофеева Н.В., Ким И.И., Нечаева Е.А. Испытания иммуномодуляторов в системе ex vivo II Новости «Вектор- Бест» (АО «Вектор-Бест», Кольцове, Новосибирская обл., Россия ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора). 2006. № 4 (42). С. 1-5.
34. Скулачев В.П. Кислород в живой> клетке: добро и зло // Природа (естественнонаучный журнал РАН). 1997. № 11. С. 26-35.
35. Стикс Г. Всепожирающее пламя // В мире науки (ScientificAmerican). № 11. С. 18-26.
36. Стоянова Л.Г., Сультимова Т.Д., Ботина С.Г., Нетрусов А.И. Выделение и идентификация низинобразующих штаммов Lactococcuslactis subsp.lactis из молока // Прикл. биохим. микробиол. 2006. Т. 42. № 5. С. 560-568.
37. Суворов А.Н. Теоретические аспекты клинического использования пробиотиков // Клиническое питание (Научно-практический журнал). 2007. № 1-2. (243). С. А68.
38. Хамагаева И.С., Качанина Л.М. Кисломолочный напиток «Целебный» //Молочная промышленность. 2005. № 5. С. 66-68.
39. Шакирзянова М.Р., Рузиева В.М., Абдульмянова Л.И., Суйдаметова Э.А., Гулямова Т.Г. Способность некоторых штаммов пропионовокис- лых бактерий, выделенных в Узбекистане, к синтезу витамина В12 // Микробиология. 2002. Т. 71. № 4. С. 570.
40. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание (в трёх томах). Т. Пробиотики и функциональное питание. М.: ГРАНТЪ. 2001. 286 с.
41. Adams М.С., Huang ProbioticPropionibacterium. United States Patent 7427397 (2008).
42. Adams M.C., Lean M.L., Hitchick N.C., Beagley K.W. The efficacy of Propionibacterium jensenii 702 to stimulate a cell-mediated response to orally administered soluble Mycobacterium tuberculosis using a mouse model / Int. Symp. onPropionubacteria and Bifidobacteria: dairy and probiotic application. (INRA-STANDA INDUSTRIE, 2004). France. Saint- Malo, June 2st-4th 2004. Session 3-1. Presentation 1720.
43. Ahern W. P., Andrist D. , Skogerson L. E. Production of fermented whey containing calcium propionate. United States Patent, 4,676,987, April 24, 1984.
44. Al-Zoreky, Ayres J.W., SandineW.E. Antimicrobial activity of Micro- gard-against food spoilage and pathogenic microorganisms // J. Dairy Sei. 1991.V. 74. P. 758-763.
45. Ayres J. W. , Sandine E., Weber G. H. Preserving foods using metabolites of Propionibacteriaother than propionic acid// United States Patent 5,096,718, March 17, 1992.
46. Babuchowski A., Laniewska-Moroz, Warminska-RadykoI. Propionibacteriain fermented vegetables // LAIT. 1999. V. 79. N.l. P. 113-124.
47. Barefoot S. , Nettles C. G. Antibiosis revisited: bacteriocins produced by dairy starter cultures // J. Dairy Sei. 1993.V. 76. P. 2366-2379.
48. Bodie E. Propionic acid fermentation of ultra-high-temperature sterilized whey using mono- and mixed cultures // Microbiol. Biotechnol. 1987. V. 25. N. 5. P. 434-437.
49. Bougie D., Roland N., Lebeurrier, Arhan P. Effect of Propionibacteriasupplementation on fecal Bifidobacteria and segmental colonic transit-time in healthy human subjects source // Scandinavian J. Gastroenterology. 1999. V. 34. N. 2. P. 144-148.
50. Bouton Y., Guyot P., Beuvier E., Tailliez P., Grappin R. Use of PCR- based methods and PFGE for typing and monitoring homofrementative lac- tobacilli during Comte cheese ripening // J. Food Microbiol. 2002. V. 31. P. 59-68.
51. BredeA., Faye Т., JohnsborgО., Odegard I., Nes I.F., Holo H. Molecular and genetic characterization of propionicin F, a bacteriocin from Propionibacterium freudenreichii //Appl. Environ. Microbiol. 2004 V. 70. N. 12. P. 73037310.

---

Страницы:   1   2